崔颖秋，韩 瑾，许澍铮，潘 敏，甄 理，张永玲，杨 昕，李 茹，李东至，廖 灿

(广州市妇女儿童医疗中心，广东 广州 510623)

唇腭裂(cleft lip with or without cleft palate,CL/P)是最常见的颜面部畸形，是世界范围内最常见的出生缺陷之一，其发病率在不同地区、种族、人群和性别中有所不同，新生儿的发病率为1‰～7‰[1]。唇腭裂不仅造成患儿的容貌畸形，影响患儿吸吮、吞咽、语言等功能及面部发育，甚至影响患儿心理发育，青少年唇腭裂者焦虑症的发病率较高，需要早期的心理干预。唇腭裂如果并发其他遗传性疾病者还伴有原发性智力低下和多器官畸形及功能异常。

唇腭裂的发病原因目前尚未完全阐明，大致可分为遗传因素、环境因素和疾病药物因素三个方面，从遗传因素可将唇腭裂病因分为三大类：染色体异常、单基因病和多基因病[2]，因此唇腭裂的复杂性增加了产前临床咨询及处理的难度。拷贝数变异(copy number variations,CNVs)是由基因组重排而导致的DNA长度>1kb的基因组大片段的拷贝数增加或减少，是基因组结构变异的重要组成部分，主要表现为染色体微缺失或微重复。CNVs目前已被广泛应用于胎儿结构畸形、原发性智力低下、生长发育迟缓、自闭症及多发畸形等异常的诊断及肿瘤遗传学诊断等领域。本研究中我们应用染色体微阵列分析(chromosome microarray analysis，CMA)对100例产前超声诊断唇腭裂胎儿进行检测，探讨唇腭裂胎儿的基因组学病因及CMA技术在唇腭裂胎儿中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选择2014年1月至2017年12月在广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心诊断的唇腭裂病例100例，其中单纯性唇裂24例，唇腭裂55例，合并其它结构畸形21例(合并神经系统异常9例、心血管畸形8例，合并腹壁畸形、肾畸形、肢体畸形及软指标各1例)。产前诊断孕妇均填写基本信息登记表，包括年龄、体重、末次月经、种族、生育史、疾病史、家族遗传病史及在本次妊娠期间是否接触过病毒感染及接触过明显致畸物质等。所有研究对象均签署知情同意书，取得医院伦理委员会的批准，征得受试者、监护者同意。

1.2 仪器和方法

CMA检测按照美国Affymetrix公司生产的CytoScan HD芯片检测的标准操作流程操作，应用配套的ChAS软件及生物信息学方法进行数据分析。参照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2009)标准进行染色体核型分析诊断，CytoScan HD芯片同时具备195万个CNV探针和75万个SNP探针。

1.3 产前诊断

在孕妇及家属知情同意下，自愿选择超声引导下羊膜腔穿刺术(16～24周)或脐带血穿刺术(>24周)，获得胎儿羊水或脐血样本。孕妇取仰卧位，常规腹壁消毒，超声(Philips iU22，荷兰)引导下行羊膜腔穿刺或脐带血穿刺术，获取胎儿标本(羊水20mL或脐带血1.5mL)。同时抽取其家系成员外周血2mL注入EDTA抗凝管中，颠倒混匀后置于4℃冰箱中保存，剩余标本置-80℃保存。

1.4 CMA数据分析

CMA数据分析采用ChAS 2.0软件，选取长度≥100kb缺失/重复片段(可信度≥90%)进行分析，数据以CEL文件格式进行分析。根据CNVs的性质不同,将其分为致病性CNVs、不明确意义CNVs(variants of unknown significance，VOUS)及良性CNVs三类。数据分析过程参考在线公共数据库如OMIM(http://www.omim.org)、DGV(http://www.projects.tcag.ca/variation)、USCS(http://genome.ucsc.edu)、PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)、DECIPHER(http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher)。

1.5 产后随访

所有病例均进行了妊娠结局及分娩后半年的随访，包括分娩的孕周、分娩方式、出生后身高、体重、阿氏评分、新生儿筛查的情况，生长发育评估中各个系统的情况及手术治疗后的效果。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件分析数据，计数资料用百分率(%)表示，用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CMA研究结果

CMA结果显示共12例病例检出致病性CNVs，致病性CNVs总检出率为12.0%(12/100)，其中唇腭裂9.1%(5/55)，合并其它畸形33.3%(7/21)，VOUS在单纯性唇裂、唇腭裂和唇腭裂合并其他畸形病例中的比例分别为0、1.8%和28.6%，见表1、表2。单纯性唇裂病例中未检测出致病性CNVs。唇腭裂胎儿和合并其他畸形异常胎儿的致病性CNVs检出率分别为9.1%(5/55)和33.3%(7/21)，比较差异有统计学意义(χ2=7.112，P<0.05)。

表1 先天性唇腭裂胎儿不同性质CNVs的检出率比较[n(%)]

2.2 产后随访

本研究对全部病例均进行了电话随访及产后超声复查，以了解患者妊娠结局及产后超声复查结果，见表2、图1、图2。

表2 12例检出致病性CNVs先天性唇腭裂胎儿列表

注：A为产前三维超声显示胎儿唇裂；B为CMA结果图，示22号染色体22q11.21-q11.22区域1.24Mb的缺失[arr22q11.21-q11.22(21464763-22706413)X1]。

图1病例3三维超声与CMA结果图
Fig.1 Image of ultrasound and CMA result of case 3

注：A1、A2为产前三维超声，显示胎儿唇腭裂；B为产前诊断病例12家系图；C1、C2为G显带染色体核型(全核型和局部核型)：46,XX,der(7)；C3为孕妇G显带染色体核型：46,XX,t(7;11)(q36;q21)；D1和D2为CMA结果图示11q21-q25 38.81Mb重复及7q36.3区域1.50Mb缺失。

图2病例12三维超声与染色体核型图及CMA结果图
Fig.2 Image of ultrasound， G-band karyotype and CMA of case 12

3 讨论

3.1 先天性唇腭裂遗传致病原因

唇腭裂的发病原因及机制极其复杂，仅通过人类孟德尔遗传在线(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)查询就可发现大约500种疾病与唇腭裂相关，其中包括100种以上的孟德尔遗传综合征、染色体片段的缺失或重复、家族遗传及散发病例。随着现代分子生物学技术的不断发展，基因研究方法的不断涌出，以及基因组序列改变引发胚胎发育异常相关研究的深入，越来越多的基因被发现与唇腭裂的发生有关，同时也对临床病因学的诊断造成困难。CNVs在许多人类疾病如发育异常、肿瘤、遗传型疾病及畸形的发生发展中起重要作用，同样也是导致先天性唇腭裂畸形的重要病因之一。本研究所使用CNVs检测技术具有高分辨识别基因组不平衡拷贝数变异、单亲二倍体(UPD)及较低水平嵌合体的CMA技术，在快速识别和鉴定疾病相关基因方面具有较高的优势。

3.2 唇腭裂致病性CNVs分析

本研究采用Affymetrix公司的CytoScan HD芯片平台共计对100例唇腭裂病例进行检测，是目前已有为数不多的大样本产前诊断唇腭裂CNVs研究，因此对临床实践具有较好的指导意义。目前国际上关于产前唇腭裂研究的一个大样本报道是香港中文大学联合贝勒医学院的多中心研究，研究共计对270例产前唇腭裂病例进行检测，其中病理性CNVs的检出率为14.8%，略高于本研究12.0%，而综合征性唇腭裂检出率为21.4%[3]，本研究为33.3%，考虑以上数据差异与不同研究的研究人群、检测平台及分析方法等有关。本研究12例CMA异常的病例中共计15个致病性CNVs，其中有8个CNVs片段小于10Mb，而这些异常片段不能常规通过G显带染色体核型技术检出，因此通过CMA的研究，可以额外检出7%的致病性CNVs。

在本研究病例中，致病性CNVs片段分布在染色体4p16.3，6q25.2，7q32-36，7q35，11q21-25，15q13.3，18q21-23，18p11.3，22q11.2，21q22.2，分别分布在不同染色体，没有明确的规律，参考唇腭裂专科数据库(Dutch Oral Cleft Registry，NVSCA)。以上研究结果均说明高分辨全基因组检测技术对先天性唇腭裂的病因学检测具有一定的优势[4]。在100例唇腭裂病例中，单纯性唇裂病例未检测出致病性CNVs，唇腭裂病例中致病性CNVs的检出率为9.1%，而合并其他畸形即综合征性唇腭裂的致病性CNVs检出率提升至33.0%，显著高于唇腭裂病例组。

3.3 典型的染色体CNVs病例分析

本研究共有2例病例诊断为22q11.2微缺失综合征，也称为腭-心-面综合征。2例胎儿均表现为先天性唇腭裂、心脏畸形。该类综合征在活产儿的发病率为1/800～1/4 000[5]，临床表现差异较大，主要表现为先天性心脏病、唇腭裂、低钙血症、面容异常、认知行为及精神异常。由于该疾病存在外显率不同，我们对2例胎儿的父母均进行了CMA检测，显示致病性CNVs均由新发突变产生，且致病区域位于经典的缺失区域。22q11.2微缺失综合征致病性区域累及30多个功能基因，其中较为热点的基因分别为TBX1、CRK1、COMT、UFD1L、DCGCR-6、GNB1L、MED15、CLTCL等，在这些功能基因中，UFD1L在胚胎组织中的表达影响腭咽弓和心脏流出道发育，编码蛋白在第1～4咽弓尖端呈高度表达，尤其在腭部发育的原始部位，是22q11为缺失病例唇腭裂形成的关键基因。

本研究中共有2例18q21缺失综合征病例，2例均常规进行G显带染色体分析，核型分别为46,XX,r(18)(p11q23)和46,XX,del(18)(q21.3)，经CMA证实均为18号染色体长臂部分缺失的畸变。18号染色体长臂部分缺失是一种少见的染色体异常改变，在活产儿中的发生率约为1/40 000[6]，临床表现差异度较大，且随着缺失片段位置及大小的不同而不同，主要表现为身材矮小、小头畸形、生长发育迟缓、精神运动发育迟缓、唇腭裂及心脏畸形等，与本研究2例病例表型基本相似。18q21缺失综合征在唇腭裂表型的关键区域[7]，包含2个重要基因，分别为SALL3基因和TSHZ1基因。SALL3基因编码蛋白属于C2H2型锌指蛋白家族，该蛋白在小鼠腭及舌中均呈高表达状态，尤其在胚胎发育期原发腭与继发腭融合时可检测到SALL3基因表达量增加[8]。另一基因TSHZ1编码的蛋白属锌指蛋白家族，在嗅球发育中起关键作用[9]。本研究中2例18q21缺失综合征的样本均表现为先天性腭裂畸形，推测与SALL3和TSHZ1基因有关，当二者发生单倍剂量不足时会导致腭裂畸形的形成。

由于产前诊断病例存在临床表型的不完整特点，建议产前诊断唇腭裂病例应用CMA检测。其中病例12，孕妇曾有唇腭裂胎儿引产史，CMA结果显示7q36.3区域出现1.50Mb缺失[arr7q36.3 (157615631-159119707)X1]及11q21-q25 38.81Mb重复[arr11q21-q25(96130099～134937416)X3]，随后检查父母染色体显示母亲染色体为46,XX,t(7;11)(q36;q21)，父亲染色体正常，该区域富含200余个OMIM基因。通过文献回顾发现11q重复综合征是较为罕见的临床综合征[9]，虽然唇腭裂的临床表现并不是常见的表现之一，但本研究孕妇曾有唇腭裂的胎儿引产史，且孕妇本人为染色体的平衡易位携带者，因此考虑两胎的唇腭裂表现均与染色体异常高度相关。该片段中包含YAP1和PVRL1基因[10]，YAP1基因编码的蛋白过度表达将影响细胞增殖、凋亡、迁移、黏附、上调ITGB2基因的表达。PVRL1基因异常与CLPED1综合征有关，即唇裂-腭发育不良综合征，患者表现为唇腭裂、手足发育异常及智力低下。在小鼠的动物模型中也证实PVRL1基因的异常会导致小数切牙及腭发育异常。Williamson等[11]在研究中发现PVRL1基因的异常与非综合征性的唇腭裂表现高度相关。除12号病例外，还有另外4例产前诊断病例均检测到致病性CNVs，但超声的表现均为单一的唇腭裂。由于产前诊断检测手段的局限和胎儿临床表型的不完整，更加说明CMA检测技术在唇腭裂病例的应用对临床指导的意义与价值。

综上所述，CMA技术也有一定的局限性，在临床实践中可能会发现大量的临床意义不明确CNVs，即VOUS，这将会给遗传咨询与临床处理带来困难。建议对病例的父母进行基因组DNA的检测以帮助诊断CNVs片段的来源以协助指导临床的咨询，由于唇腭裂是高发的胎儿出生缺陷之一，且是多种染色体异常和综合征的表现之一，因此建议对唇腭裂胎儿进行CMA检查进行产前诊断。