胡 蕾，刘礼辉，杨圆圆，方 伟，林 强，付小哲，梁红茹，刘山桂，李宁求

(1.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部渔用药物创制重点实验室，广东省水产动物免疫技术重点实验室，广州 510380；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3.广东省水生动物疫病预防控制中心，广州 510220)

杂交鳢(Channamaculate♀×C.argus♂)是我国重要的淡水经济鱼类，具有生长速度快、抗逆性强、产量高等杂交优势[1]。虽然杂交鳢抗病能力极强，但是在高密度养殖条件下，养殖水体水质较差，导致疾病频发，其中内脏类结节病是近年来常见疾病之一。该病发病率高，死亡率大，已给不少养殖场造成重大损失。舒伯特气单胞菌(Aeromanasschubertii)属气单胞菌科(Aeromonadaceae)气单胞菌属(Aeromanas)，为革兰氏阴性杆菌，单极鞭毛，运动能力强，是引起鳢科鱼类内脏类结节病的主要病原之一。1988年在美国[2]德克萨斯州首次发现舒伯特气单胞菌，其后又在欧洲[3-4]及中国[5-6]也发现了大量由舒伯特气单胞菌引起的食源性疾病的病例。2009年余华等[7]从温泉鱼上分离到舒伯特气单胞菌，2012年罗霞等[8]相继报道了舒伯特气单胞菌引起的鳢科鱼类内脏类结节病，对鳢科鱼类具有较高的致病力和致死性。目前舒伯特气单胞菌病的防治主要依靠化学药物，但该方法存在药物残留、产生耐药性等弊端，给食品安全带来严重隐患。通过免疫接种预防鱼类疾病的发生是最为经济有效的手段[8，18]，但目前未见有舒伯特气单胞菌疫苗的报道。舒伯特气单胞菌在体内形成类结节，以产生体液免疫应答为主的灭活疫苗效果不佳，而弱毒疫苗除了引发体液免疫外，亦可产生强烈的细胞免疫应答，因此研制舒伯特气单胞菌弱毒疫苗预防杂交鳢类结节病更具优势。

本研究通过筛选天然致弱的舒伯特气单胞菌毒株作为制备弱毒疫苗候选，采用IL-8、IL-1β、补体3(C3)和免疫球蛋白(IgM)等免疫相关基因表达及相对免疫保护率(relative percentage survival，RPS)等指标评价了舒伯特气单胞菌弱毒疫苗引起的杂交鳢免疫应答及其免疫保护效果，为开发安全、高效的鳢科鱼类舒伯特气单胞菌弱毒疫苗奠定基础。

1 材料方法

1.1 菌株与实验鱼

舒伯特气单胞菌株OM170701、OM170703、OC170905、OC170908、WL1483由珠江水产研究所鱼病室从患病的杂交鳢等分离、鉴定、保存。实验用杂交鳢、大口黑鲈购自广东顺德某养殖场，健康，无发病史，镜检无寄生虫，体质量20～140 g，实验前暂养于500 L蓝色塑料桶中15 d，充气，每天投喂适当的广东旺海饲料实业有限公司生产的饲料，每天换水1/2，水温为26～28 ℃。

1.2 舒伯特气单胞菌弱毒菌株的筛选

1.2.1 菌株的准备

将保存的OM170701、OM170703、OC170905、OC170908菌种分别接种于固体BHI平板上，28 ℃恒温培养24 h，挑取单菌落，接种于100 mL BHI液体培养基，28 ℃振荡160 r/min培养4 h，根据文献[8,18]和本实验前期试验结果，舒伯特气单胞菌在1.0×104数量级就会造成鱼体的死亡，本实验在此基础上提高3个数量级的浓度感染鱼体，对4株菌株对杂交鳢的毒力进行初筛，这个浓度可以获得毒性相对较弱的菌株，因此选用生理盐水调整菌液浓度为4.5×107CFU/mL用于攻毒。

1.2.2 攻毒试验

将50尾杂交鳢随机分为5组，其中4组为试验组，每组10尾放于200 L塑料桶，分别腹腔注射浓度为4.5×107CFU/mL的OM170701、OM170703、OC170905、OC170908菌悬液，每尾0.1 mL，对照组腹腔注射等量的生理盐水。注射后每天换水，连续观察7 d，记录杂交鳢的死亡情况，如有死亡，检测死亡的杂交鳢是否是因为舒伯特气单胞菌引起的。

1.3 舒伯特气单胞菌弱毒株安全性评价

1.3.1 舒伯特气单胞菌弱毒株对靶动物杂交鳢安全性

将120尾杂交鳢随机分成4组，每组30尾。其中3组为试验组，分别腹腔注射浓度为4.5×109、4.5×108、4.5×107CFU/mL OM170701菌悬液，每尾0.1 mL，对照组腹腔注射等量生理盐水。注射后连续观察18 d，记录试验组死亡情况。

1.3.2 舒伯特气单胞菌弱毒株对非靶动物大口黑鲈的安全性

根据兽用生物制品研发与申报要求，需对使用动物和非使用对象动物进行实验室安全试验。因为杂交鳢和大口黑鲈都同在一个养殖区域内，因此选大口黑鲈作为非靶动物的验证，可以避免弱毒株对大口黑鲈感染的情况出现，也可避免以后在对杂交鳢使用该疫苗免疫时，对大口黑鲈的养殖带来安全隐患。实验方法同1.3.1。

1.4 疫苗的制备及免疫

将保存的OM170701菌种接种于固体BHI平板上，28 ℃恒温培养24 h，挑取单菌落，接种于100 mL BHI液体培养基，28 ℃过夜培养，用生理盐水稀释至4.5×107CFU/mL，用于注射免疫。将480尾杂交鳢随机分为2组，每组240尾，设3个平行，其中免疫组注射浓度为4.5×107CFU/mL OM170701菌液，每尾0.1 mL，对照组注射等量的生理盐水。

1.5 菌株OM170701在杂交鳢体内的消长规律

免疫后第1、2、3、4、5、6、7、14天3个免疫平行组每组随机抽取3尾杂交鳢，取其肝、脾、肾、肠、鳃、心脏、肌肉，脑组织，称取30 mg，按照天根细菌基因组DNA试剂盒说明书提取DNA。采用刘礼辉等[12]建立的舒伯特气单胞菌检测方法，检测菌株OM170701在体内的组织分布及消长规律。

1.6 免疫相关基因定量检测

1.6.1 RNA的提取及cDNA的合成

免疫后第0、12、24、48、72 h以及第7、14、21、28天3个免疫平行组每组随机抽取3尾杂交鳢，取其肝脏组织，按照天根提取动物组织RNA试剂盒说明书提取RNA，用TransScript & One-Step gDNA Removal and cDNASynthesis SuperMix(北京全式金)进行反转录，合成cDNA第一链。

1.6.2 定量PCR检测

以cDNA第一链为模板，在ABI7500(applied biosystems)实时荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR检测。反应体系和反应程序按照试剂盒SYBR Premix EX TapTMⅡ(Tli RNaseH plus)(宝生物工程)说明书操作。采用2-ΔΔCt法计算样品中IL-8、IL-1β、补体3(C3)、免疫球蛋白(IgM)的相对表达量，β-actin为内参基因。引物序列见表1。

表1 qPCR所用引物及引物序列Tab.1 Primers and primer sequences used in qPCR

1.7 RPS的测定

免疫后第28天采用舒伯特气单胞菌强毒株WL1483注射攻毒，注射浓度为1.5×104CFU/mL，每尾0.1 mL，连续观察14 d，记录鱼体死亡情况，对发病和死亡个体进行病原的分离和鉴定，并计算相对免疫保护率(relative percentage survival，RPS):

RPS=(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)×100%。

1.8 数据分析

实验所得数据均表示为平均数±标准差(X±SD)，采用OringinPro 6.0软件进行数据处理，并采用t检验进行差异性分析，当P<0.05时表示差异显著。

2 结果

2.1 舒伯特气单胞菌弱毒菌株的筛选

舒伯特气单胞菌攻毒后，OM170701、OM170703、OC170905和OC170908组杂交鳢的死亡率分别是0、20%、70%、100%(图1)。其中，OC170908组杂交鳢在攻毒后第3天急剧死亡，并在第6天全部死亡，说明OC170908对杂交鳢具有极强的致病力和高致死率。OM170703组和OC170905组的死亡情况在攻毒后的第6天达到稳定，其中OC170905组的死亡率在50% 以上，说明OC170905对杂交鳢的致病力虽然弱于OC170908，但仍具有很强的致病力，OM170703的致死率为20%，且在第3天才出现死亡，所以其致病力较弱。OM170701组杂交鳢无死亡，说明OM170701对杂交鳢毒性较弱。

图1 感染不同菌株的各实验组累计死亡曲线Fig.1 Cumulative mortality curves of different experimental groups injected with different bacterial strain

2.2 舒伯特气单胞菌弱毒株安全性评价

分别以浓度为4.5×109、4.5×108、4.5×107CFU/mL的OM170701菌液感染靶动物杂交鳢与非靶动物大口黑鲈，在观察期内均未出现死亡，由此说明此菌株对杂交鳢和大口黑鲈毒性较弱，候选菌株用作弱毒苗制备安全性较好。

2.3 舒伯特气单胞菌弱毒株在杂交鳢体内组织分布及消长规律

舒伯特气单胞菌弱毒株OM170701接种杂交鳢后，在肠、肝脏、肌肉、鳃、脾、肾中均能检测到OM170701，而在脑中检测不到。在这些组织中，OM170701量均在第2天达到最大，随后减少。其中在肝脏中存在的时间最长，直到第7天检测不到OM170701，在鳃中的存在时间最短，第4天就检测不到OM170701。在肠、肾中存在时间为5 d，肌肉、脾中存在时间为4 d。在肠中的量最高，为104.194个拷贝数(图2)。

图2 弱毒疫苗株OM170701在杂交鳢体内组织分布及消长情况Fig.2 Tissue distribution and growth of attenuated vaccine strain OM170701 in hybrid snakehead

2.4 免疫后杂交鳢细胞因子IL-8、IL-1β、补体C3的表达情况

舒伯特气单胞菌弱毒株OM170701免疫组IL-8、IL-1β、补体C3表达量均依次升高且高于对照组表达量，在免疫后12 h与24 h升高不明显，48 h相对表达量显著升高，在72 h相对表达量达到最高，分别是对照组的5.57倍，3.94倍，4.95倍(图3)。

2.5 免疫后杂交鳢免疫球蛋白IgM基因表达情况

舒伯特气单胞菌弱毒株OM170701接种杂交鳢后，第7天至第28天IgM的相对表达量依次升高且均高于对照组的表达量，第7天至第21天免疫组相对表达量较对照组表达量高，到第28天免疫组IgM的表达量显著高于对照组的表达量，是对照组的17.26倍(图4)。

图3 免疫后杂交鳢肝脏内非特异性细胞因子的相对表达水平Fig.3 Relative expression level of nonspecific immune genes in liver of immunized hybrid snakehead *表示P<0.05

图4 免疫后杂交鳢肝脏内免疫球蛋白IgM基因的相对表达水平Fig.4 Relative expression level of specific immune gene IgM in liver of immunized hybrid snakehead

2.5 RPS的测定

免疫后第18 天，用舒伯特气单胞菌强毒株WL1483进行活菌攻毒，结果显示，对照组杂交鳢第1天开始出现死亡，而OM170701注射免疫组从第2天开始出现死亡，部分死亡个体内脏(肝、脾、肾等)出现白点，死亡后可从杂交鳢肝、脾、肾等部位分离到舒伯特气单胞菌。实验期间免疫组累计死亡率为17.78%，对照组累计死亡率为50.1%(图5)，该疫苗对杂交鳢的RPS为65%。

3 讨论

国际上有多种鱼类弱毒疫苗开发成功，其中柱状黄杆菌减毒活疫苗Aquavac-Col已在美国批准上市[13]，大菱鲆迟缓爱德华菌活疫苗获得国家新兽药证书[14]。庞晓茹[15]、Cheng等[16]、Takano等[17]筛选了迟缓爱德华菌天然弱毒株疫苗，付小哲等[13]通过链霉素连续传代诱导获得的约氏黄杆菌减毒株等也在实验室取得较好的免疫保护效果。

图5 舒伯特气单胞菌强攻毒后免疫组与对照组累计死亡率Fig.5 Accumulated mortality of immunization group and control group after challenge

此研究中通过筛选获得的天然弱毒株，与罗霞等[8]、刘春等[18]、Liu等[19]分离的舒伯特气单胞菌强度株比较，对杂交鳢和大口黑鲈的毒性较弱。通过注射免疫杂交鳢后，第28 天RPS为65%，表明该舒伯特气单胞菌弱毒活疫苗具有良好的免疫保护效果。而付小哲等[13]用约氏黄杆菌减毒株制备疫苗浸泡免疫鳜鱼后第 28 天 RPS 为85.9%，造成这种差异的原因可能与鳜体表具有发达的黏膜免疫系统有关。 RPS是评价疫苗免疫效果最直接指标，不同弱毒株保护率存在差异可能与种类、鱼类品种、免疫途径等存在密切的关系[13]。

IL-8是趋化因子家族中的重要成员，它能帮助中性粒细胞迁移至病原侵入的部位。另外，据报道IL-8也能促进其他细胞因子的表达[17,20]。IL-1β是一种典型的促炎症因子，由包括巨噬细胞在内的多种细胞产生，它能促进免疫细胞的增殖并作为早期免疫反应的重要信号[21]。IL-1β表达水平的变化说明了疫苗进入鱼体后起到了对免疫系统的调节作用[22]。补体由多种具有酶活性的球蛋白组成，不仅是自然免疫的重要组成部分，同时也在获得免疫中发挥作用[23-24]，能够增强体液和细胞介导的特异性免疫[25]。其中补体C3(complement 3，C3)是补体系统中含量最高的成分，可同时参与补体系统的三种激活途径[26]。张智慧[27]制备了鳗弧菌减毒活疫苗，免疫鱼体后，鱼体内相关免疫因子IL-8、IL-1β、补体C3的表达量均为上调，说明鳗弧菌减毒活疫苗能引起鱼体的免疫应答。在该研究中，疫苗免疫鱼体后，在杂交鳢肝脏中IL-8、IL-1β、补体C3的表达量均为上调，这与张智慧[27]的研究结果一致，说明该弱毒活疫苗能有效激发宿主免疫细胞的趋化作用，能激活先天免疫反应，并通过巨噬细胞吞噬后激发宿主的适应性免疫应答，还能诱导杂交鳢体内补体C3含量的增加，从而激活杂交鳢非特异性免疫防御机制，抵御外来微生物入侵。

IgM是特异性免疫应答中的标记基因，是硬骨鱼类主要的免疫球蛋白形式[28]。抗原刺激机体后，机体产生的抗体IgM会参与初次免疫反应[29]。付小哲等[13]通过制备约氏黄杆菌减毒活疫苗，免疫鱼体后，特异性免疫因子IgM的相对表达量上调，说明该疫苗能诱导鱼体的免疫应答。舒伯特气单胞菌弱毒活疫苗OM170701株免疫杂交鳢后，在免疫后的第28天，IgM表达水平达到最高，此结果与付小哲等[13]的研究结果一致，说明该弱毒疫苗株也可引起杂交鳢特异性免疫应答。

综上所述，舒伯特气单胞菌弱毒株OM170701注射免疫杂交鳢可诱导杂交鳢相关免疫因子IL-8、IL-1β、补体C3基因表达上调，特异性免疫因子IgM的相对表达量上调，RPS可达65%，表明该疫苗可有效防治舒伯特气单胞菌导致的杂交鳢类结节病。