韦武均 邓益斌

[专家介绍]邓益斌，教授、主任技师，医学博士，博士研究生导师，临床检验诊断学学科带头人，美国弗吉尼亚联邦大学高访归国学者。现任右江民族医学院附属医院（临床医学院）副院长兼发展规划处副处长。主要从事抗HBV基因治疗、HBV相关肝癌非编码RNA调控机制、瑶医药活性分子应用价值研究。担任国家自然科学基金函审专家，广西科技计划项目评审专家，广西卫生食品安全风险评估专家。现为广西医学会医学教育学分会委员、精准医学分会委员、检验医学分会委员、广西医师协会检验医师分会常务委员、伦理医师分会委员。担任《中华肿瘤防治杂志》《世界华人消化杂志》《右江医学》及《右江民族医学院学报》杂志编委。主持国家自然科学基金2项、广西自然科学基金2项、广西教育厅资助课题3项、广西卫生厅资助课题2项;以第一作者和通信作者公开发表学术论著58篇，其中SCI收录10篇;主（参）编著作/教材2部;获百色市科技进步二等奖1项、科技创新三等奖1项。

【摘要】 抗乙型肝炎病毒（HBV）免疫治疗主要通过介导激活免疫细胞及释放细胞因子发挥免疫调控作用，增强宿主产生有效的先天性和适应性免疫应答，从而有效抑制HBV复制与转录，实现长期稳定的控制。该综述总结抗HBV免疫治疗的几种策略，以期找到清除HBV共价闭合环状DNA治疗新方法或药物，为HBV抗病毒治疗提供参考。

【關键词】 乙型肝炎病毒;共价闭合环状DNA;免疫治疗

中图分类号：R512.62   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.08.001

【Abstract】  Immunotherapy mostly plays an role of immune regulatory in anti-hepatitis B virus（HBV） by mediating activation of immune cells and releasing cytokines，which produces effective innate and adaptive immune responses through enhancing the host，thus effectively inhibiting HBV replication and transcription，and achieving long-term stability control.This article reviews several strategies for anti-HBV immunotherapy in order to find new methods or drugs for clearing covalently closed circular DNA of HBV，providing reference for HBV antiviral therapy.

【Key words】 HBV;covalently closed circular DNA;immunotherapy

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染仍是人类主要关注的全球性健康问题，全球约有3.5亿HBV携带者，其中慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）感染者约2.4 亿，以非洲中部、美洲中部、中欧地区及东南亚尤为明显。CHB极易发展为肝硬化、肝细胞癌（HCC）等严重肝脏病变，每年约有 100万人死于HBV 感染及相关疾病[1～2]。目前， 临床抗CHB药物主要有干扰素α、核苷（酸）类似物、中医中药等。干扰素α通过与靶细胞表面受体结合，诱导合成抗病毒蛋白抑制病毒复制，介导免疫细胞发挥抗病毒效应，其副作用较大[3～5];核苷（酸）类似物主要通过靶向抑制病毒DNA聚合酶活性发挥抗病毒作用，长期使用容易产生变异性耐药及停药反弹[6];中医中药抗病毒机制及靶点尚不清楚[7～8]。因此，临床急需寻找到能够持续抑制HBV复制与转录或能彻底清除病毒cccDNA的新方法或药物。由于病毒感染诱导宿主免疫系统对病毒产生免疫应答反应，导致宿主肝脏不同程度损害，而抗病毒免疫治疗能温和激活宿主先天性和适应性免疫应答产生抗病毒抗体，从而达到防治HBV感染的作用。现就间质干细胞（MSC）移植、树突状细胞（DC）、自然杀伤（NK）细胞、靶向T细胞、Toll样受体（TLRs）、抗PD-1/PD-L1抑制剂、胸腺肽α1调节剂及治疗性疫苗的抗HBV免疫治疗进行综述，以期为HBV抗病毒治疗提供参考。

1 间质干细胞（MSC）移植治疗

MSC移植治疗不仅能分化成机体肝细胞，还能有效清除体内HBV并改善免疫调节功能。Fang等用人脐带间质干细胞对50名乙型肝炎病毒引起的失代偿期肝硬化患者进行双重移植后，经2至48周治疗，发现患者体内抑制性因子白细胞介素-10、协调性T细胞、转化生长因子β水平明显升高，而白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞及ALT水平显著下降，但白蛋白、总胆红素和凝血酶原时间明显改善，转化为肝癌或死亡的患者极少[9]。Qu等使用MSC经尾静脉注射含HBV感染的动物模型，能通过分泌转化生长因子-β1抑制NK成员（NKG2D）的表达来调节NK毒性对肝脏损伤的影响，降低NK细胞在肝脏的过表达，从而减轻其对肝脏的损伤，发挥适宜的免疫调节效能，减少炎细胞的浸润，但HBV复制与转录表达增加，延长治疗时间[10]。MSC治疗有独特的免疫调节特性，安全性好，已有一定的临床应用价值，但清除HBV DNA的能力不足[11]。

2 树突状细胞（DC）治疗

DC以各种类型存在于肝脏中，是一种较强的抗原呈递细胞（APC），能分泌相应的细胞因子或趋化因子来抑制HBV表达。浆细胞样树突状细胞（pDC）亚群约占肝脏总DC的10%，主要产生I型干扰素（IFN），其IFN-α能降低HBV cccDNA微染色体前基因组RNA（pgRNA）和亚基因组RNA的转录，使结合组蛋白低乙酰化并降低与STAT1和STAT2转录因子结合，达到抑制HBV复制与转录的目的[12～13]。DC亚型BDCA3（+）/CLEC9A（+）DC通过分泌 IFN-λ3对HBV感染宿主进行免疫调节与抗病毒作用[14～15]。在早期临床研究中，Chen等对19名CHB患者进行DC脉冲治疗，有10名患者HBeAg血清学转化，HBV DNA拷贝数平均下降0.02～1.74倍，其中2名患者用DC与拉米夫定联合同时治疗1年，清除HBV DNA的效果明显[16]。Zhuang等发现DC的长链非编码RNA能介导TLR9/STAT3信号传导并降低分泌TNF-α、IL-6、IL-12和IFN-γ的浓度，增加IL-1β浓度激活免疫应答控制HBV表达，降低HBV DNA水平[17]。因此，DC是极重要的抗病毒先天细胞，能介导抗病毒和诱导耐受性免疫应答，在HBV细胞疫苗方面有潜在价值[18]，但易发生HBV免疫逃逸，无法有效监视和清除HBV病毒。

3 自然杀伤（NK）细胞治疗

NK细胞作为先天性免疫的关键组成部分，主要有亮CD56与暗CD56两种亚型及多种表型，富集于肝脏淋巴细胞，在防御HBV感染中发挥重要作用。NK细胞在控制病毒性肝炎、肝纤维化和肝肿瘤发生中发挥着重要的作用，激活的NK细胞可以通过分泌天然毒性或细胞因子实现免疫调节作用来抑制HBV病毒感染[19～21]。NK细胞在HBV转染小鼠体内是通过分泌IFN-γ 来增强CD8+T细胞活化，对HBV病毒进行的免疫应答，降低HBsAg的含量[22]。聚胞苷酸恢复NK活化和功能后促进IFN-γ的产生及病毒的清除，可导致HBV耐受小鼠及转基因小鼠体内病毒含量减少，有助于抑制HBV的复制及病毒的清除[23]。NK细胞可被NK家族2D、2A受体及跨膜糖蛋白46激活来调节抗HBV反应，阻断HBV DNA的复制，同时降低NK细胞毒性反应[24～25]。NK细胞在HBV感染中起重要的控制作用，可直接清除病毒细胞，但过度活化NK细胞会增加细胞毒性使肝受损加重，经过改造的NK细胞治疗将成为免疫治疗的趋势。

4 靶向T细胞治疗

靶向T细胞在控制HBV感染及有效清除病毒中发挥重要的作用，在 CHB患者中发现相应细胞因子产生减少及多种抑制分子表达升高，缺乏特异性结合受体与T（CD4+T/CD8+T）细胞，造成T淋巴细胞功能耗竭，尤其缺乏特异CD8+T细胞[26～27]。特异性CD8+T细胞受IL-35影响，通过下调IL-35及诱导调节性T细胞（Treg）增强对HBV的免疫应答并抑制其表达，控制病毒与炎症反应[28]。通过线粒体靶向抗氧化剂的抗氧化恢复特异CD8+T细胞功能，促进对HBV病毒的非细胞溶解作用[29]。T细胞产生的IFN-γ或TNF-α能通过激活肝细胞上编辑酶催化亚基3A/3B（APOBEC3A/3B）诱导脱氨基使HBV cccDNA衰竭并将其清除，从而控制HBV病毒的复制[30]。目前， T细胞经遗传修饰以表达HBV特异性T细胞受体（TCR）、嵌合抗原受体（CAR-T）及采用mRNA电穿孔设计表达HBV特异性TCR在CHB抗病毒中得到验证，有效清除HBV cccDNA，降低细胞毒性及肝脏炎性损伤[31～32]。靶向T细胞在抗HBV免疫治疗领域具有很好的前景，尤其是改造后的T细胞，但不能彻底清除HBV cccDNA，在治疗的重定位方面有待观察，生产成本高，应用复杂，大规模开发个体化的治疗仍然存在许多问题。

5 Toll样受体（TLRs）治疗

TLRs是能识别病原体相关分子模式（PAMPs）并激活先天免疫进行一系列防御的高度保守分子，几乎依赖髓样分化初级应答蛋白88（MyD88）途径导致下游信号转导并激活参与抗病毒反应，部分TLRs亚组在控制CHB感染中得到有效应用[33]。Das等通过特异性脂多糖激活TLR4在HepG2.2.15细胞进行体外实验，发现能降低HBV DNA、mRNA及蛋白质表达，抑制HBV复制与转录，从而有效控制和清除病毒[34]。Zhang 等发现TLR2介导的先天免疫反应可阻断HepG2.2.15细胞及原代土拨鼠肝细胞中HBV复制[35]。早期研究发现单次剂量静脉注射TLR3、TLR4、TLR5、TLR7或TLR9配体能以I型干扰素依赖性方式阻断HBV转基因小鼠体内病毒的复制[36]。TLR7与TLR8受体能识别单链RNA，表达于不同来源的DC细胞膜内发挥早期的免疫作用。最近，Mcgowan等研究发现一系列嘧啶TLR7与TLR8样受体激动剂其50D能间接诱导内源性IFN-γ，在HepG2细胞及慢性HBV小鼠模型中降低HBsAg和病毒载量，稳定性及安全性良好，毒副作用弱[37]。TLRs能介导信号传导途径激活对HBV复制的直接抑制及增强HBV特异性CD8+T细胞发挥免疫应答，但抗病毒特异性不强，清除病毒能力不足，只能延缓病毒传播。

6 抗PD-1/PD-L1抑制剂

PD-1/PD-L1是一种主要作用于免疫检查点的程序性死亡蛋白1及PD-1配体的抑制分子，已在临床免疫治疗癌症方面得到有效的应用。已知CHB持续感染者T细胞功能衰竭及缺乏特异性CD8+T细胞，PD-1又高表达于活性CD8+T细胞，因此，PD-1在HBV治疗方面也得到更多关注[27，38]。Tang等通过体外细胞培养并阻断PD-1/PD-L1结合，观察对52名CHB患者T细胞表面CD28家族共刺激及抑制受体的影响，发现能恢复T细胞功能及增强IFN-γ的表达，减少HBV DNA的含量[39]。Balsitis等通过HBV感染土拨鼠模型并针对其体内PD-L1制备类似人的单克隆抗体（αPD-L1）来阻断PD-1 / PD-L1相互作用，发现小鼠体内病毒抗原及DNA降低，无严重的肝损害，并且可以与核苷酸类药物联合使用发挥更好效应[40]。PD-1/PD-L1抗HBV阻断药物的研发，为慢性HBV患者提供免疫检查点抑制治疗，有效控制HBV病毒，增强特异性T细胞识别和清除HBV cccDNA能力，但安全性仍有待观察。

7 胸腺肽α1（Tα1）调节剂

Tα1是一种对T细胞、NK细胞和DC具有多效活性的肽生物免疫调节剂，在激活和调节免疫系统中起重要作用，经过长期研究发现Tα1依赖性剂量与时间能有效控制HBV相关性肝癌[41]。Tα1不仅能联合干扰素增强免疫治疗HBV，有效清除HBsAg和HBeAg，其与核苷（酸）类似物联合用药能更好地控制和清除病毒，为CHB感染者提供有效的临床治疗方案，安全性与耐受性良好，但药物靶向性及彻底清除病毒能力有待研究[42～43]。

8 治疗性疫苗

治疗性疫苗主要是通过激活患者自身的免疫系统来对抗并最终控制或清除病原体，常用的包括蛋白质疫苗、DNA疫苗、活载体疫苗、肽疫苗及细胞疫苗等[44]。基于基因重组的HBV疫苗得到快速发展，King等针对HBV保守区设计表达HBV X、S、C重组酵母疫苗GS-4774免疫离体小鼠T细胞及与DC共培养，诱导HBV特异性CD4+和CD8+T细胞免疫应答及表达溶酶体相關膜蛋白1，产生辅助T细胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α，降低病毒载量，还能过继抑制表达HBsAg和HBcAg融合EL4肿瘤生长，初步用于临床试验[45]。HBV疫苗Engerix-B诱导保护性抗HBs应答及逆转宿主免疫耐受在AAV/HBV小鼠体内中得到验证，与CpG-佐剂和中和抗体联合治疗效果更佳，使体内HBsAg、HBeAg、HBcAg及HBV DNA降低，持续作用时间长[46]。HBV具有多种基因型和亚型，使得有效疫苗的开发变得复杂和昂贵，治疗性疫苗安全无毒副作用，但难突破免疫耐受和逃逸，缺乏个体化治愈。

综上所述，抗HBV免疫治疗主要通过介导激活NK细胞分泌天然毒性或细胞因子实现免疫调控作用来抑制HBV病毒表达，促进 DC增殖成熟、阻断T细胞上PD-1/PD-L1结合及恢复HBV特异性T（CD4+T/CD8+ T）细胞增强宿主产生有效的先天性和适应性免疫应答，进行联合治疗，从而有效抑制HBV复制与转录，降低HBV抗原和病毒载量，实现长期稳定的控制，但不能从源头上彻底清除HBVcccDNA。实现完全治愈HBV感染者有效的方法可能需要从源头上阻断HBV复制或使HBV与宿主特异细胞结合而被清除。近年来，人们对HBV病毒学和宿主对其免疫反应的研究取得显著进展，期待寻找到有效彻底清除HBV DNA与HBV cccDNA的新疗法或新药物，为HBV感染者提供功能性治愈可能。

参 考 文 献

[1] Stanaway JD，Flaxman AD，Naghavi M，et al.The global burden of viral hepatitis from 1990 to 2013：findings from the Global Burden of Disease Study 2013[J].Lancet，2016，388（10049）：1081-1088.

[2]  Trepo C，Chan HL，Lok A.Hepatitis B virus infection[J].Lancet，2014，384（9959）：2053-2063.

[3]  王芳芳，张国范，郭春霞，等.长期口服恩替卡韦治疗的慢性乙型肝炎患者换用α干扰素治疗临床疗效随访研究[J].实用肝脏病杂志，2018，21（5）：721-724.

[4]  Garcia-Sastre A，Biron CA.Type 1 interferons and the virus-host relationship：a lesson in detente [J].Science，2006，312（5775）：879-882.

[5]  Korkmaz P，Usluer G，Ozgunes I，et al.Comparison of adefovir dipivoxil and pegylated interferon alpha-2a treatment in chronic hepatitis B patients[J].North Clin Istanb，2014，1（1）：26-32.

[6]  Kang L，Pan J，Wu J，et al.Anti-HBV Drugs：Progress，Unmet Needs，and New Hope[J].Viruses，2015，7（9）：4960-4977.

[7]  马文心.中医中药治乙肝的临床效果观察[J].大家健康（学术版），2014，8（21）：43-44.

[8]  Xia J，Inagaki Y，Song P，et al.Advance in studies on traditional Chinese medicines to treat infection with the hepatitis B virus and hepatitis C virus[J].Biosci Trends，2016，10（5）：327-336.

[9]  Fang X，Liu L，Dong J，et al.A study about immunomodulatory effect and efficacy and prognosis of human umbilical cord mesenchymal stem cells in patients with chronic hepatitis B-induced decompensated liver cirrhosis[J].J Gastroenterol Hepatol，2018，33（4）：774-780.

[10] Qu M，Yuan X，Liu D，et al.Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Attenuate Immune-Mediated Liver Injury and Compromise Virus Control During Acute Hepatitis B Virus Infection in Mice[J].Stem Cells Dev，2017，26（11）：818-827.

[11] 于雙杰，陈黎明，吕飒，等.人脐带间充质干细胞治疗失代偿性乙型肝炎肝硬化的安全性与疗效[J].中华肝脏病杂志，2016，24（1）：51-55.

[12] Swiecki M，Colonna M.The multifaceted biology of plasmacytoid dendritic cells[J].Nat Rev Immunol，2015，15（8）：471-485.

[13] Belloni L，Allweiss L，Guerrieri F，et al.IFN-alpha inhibits HBV transcription and replication in cell culture and in humanized mice by targeting the epigenetic regulation of the nuclear cccDNA minichromosome[J].J Clin Invest，2012，122（2）：529-537.

[14] van der Aa E，van Montfoort N，Woltman AM.BDCA3（+）CLEC9A（+） human dendritic cell function and development[J].Semin Cell Dev Biol，2015，41：39-48.

[15] Yoshio S，Kanto T.Host-virus interactions in hepatitis B and hepatitis C infection[J].J Gastroenterol，2016，51（5）：409-420.

[16] Chen M，Li YG，Zhang DZ，et al.Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine on patients with chronic hepatitis B：a clinical study[J].World J Gastroenterol，2005，11（12）：1806-1808.

[17] Zhuang L，Tian J，Zhang X，et al.Lnc-DC regulates cellular turnover and the HBV-induced immune response by TLR9/STAT3 signaling in dendritic cells[J].Cell Mol Biol Lett，2018，23：43.

[18] 謝丽平，林涛发，朱玲玲，等.慢性乙型肝炎患者在HBV不同抗原负载下树突状细胞功能的变化[J].肝脏，2017，22（7）：594-596.

[19] Han Q，Zhang C，Zhang J，et al.The role of innate immunity in HBV infection[J].Semin Immunopathol，2013，35（1）：23-38.

[20] Zheng M，Sun H，Tian Z.Natural killer cells in liver diseases[J].Front Med，2018，12（3）：269-279.

[21] 胡辛，胡春松，黄保军.自然杀伤细胞分泌干扰素γ促进乙肝病毒的清除[J].安徽医科大学学报，2017，52（2）：215-220.

[22] Zheng M，Sun R，Wei H，et al.NK Cells Help Induce Anti-Hepatitis B Virus CD8+T Cell Immunity in Mice[J].J Immunol，2016，196（10）：4122-4131.

[23] Tong S，Liu G，Li M，et al.Natural killer cell activation contributes to hepatitis B viral control in a mouse model[J].Sci Rep，2017，7（1）：314.

[24] Wang Y，Wang W，Shen C，et al.NKG2D modulates aggravation of liver inflammation by activating NK cells in HBV infection[J].Sci Rep，2017，7（1）：88.

[25] Yoshioka T，Tatsumi T，Miyagi T，et al.Frequency and role of NKp46 and NKG2A in hepatitis B virus infection[J].PLoS One，2017，12（3）：e174103.

[26] Park JJ，Wong DK，Wahed AS，et al.Hepatitis B Virus-Specific and Global T-Cell Dysfunction in Chronic Hepatitis B[J].Gastroenterology，2016，150（3）：684-695.

[27] Kah J，Koh S，Volz T，et al.Lymphocytes transiently expressing virus-specific T cell receptors reduce hepatitis B virus infection[J].J Clin Invest，2017，127（8）：3177-3188.

[28] Shao X，Ma J，Jia S，et al.Interleukin-35 Suppresses Antiviral Immune Response in Chronic Hepatitis B Virus Infection[J].Front Cell Infect Microbiol，2017，7：472.

[29] Fisicaro P，Barili V，Montanini B，et al.Targeting mitochondrial dysfunction can restore antiviral activity of exhausted HBV-specific CD8 T cells in chronic hepatitis B[J].Nat Med，2017，23（3）：327-336.

[30] Xia Y，Stadler D，Lucifora J，et al.Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form，cccDNA，Without Cytolysis[J].Gastroenterology，2016，150（1）：194-205.

[31] Koh S，Shimasaki N，Bertoletti A.Redirecting T Cell Specificity Using T Cell Receptor Messenger RNA Electroporation[J].Methods Mol Biol，2016，1428：285-296.

[32] Kah J，Koh S，Volz T，et al.Lymphocytes transiently expressing virus-specific T cell receptors reduce hepatitis B virus infection[J].J Clin Invest，2017，127（8）：3177-3188.

[33] Zhang E，Lu M.Toll-like receptor（TLR）-mediated innate immune responses in the control of hepatitis B virus（HBV） infection[J].Med Microbiol Immunol，2015，204（1）：11-20.

[34] Das D，Sarkar N，Sengupta I，et al.Anti-viral role of toll like receptor 4 in hepatitis B virus infection：An in vitro study[J].World J Gastroenterol，2016，22（47）：10341-10352.

[35] Zhang X，Ma Z，Liu H，et al.Role of Toll-like receptor 2 in the immune response against hepadnaviral infection[J].J Hepatol，2012，57（3）：522-528.

[36] Isogawa M，Robek MD，Furuichi Y，et al.Toll-like receptor signaling inhibits hepatitis B virus replication in vivo[J].J Virol，2005，79（11）：7269-7272.

[37] Mcgowan D，Herschke F，Pauwels F，et al.Novel Pyrimidine Toll-like Receptor 7 and 8 Dual Agonists to Treat Hepatitis B Virus[J].J Med Chem，2016，59（17）：7936-7949.

[38] Alsaab HO，Sau S，Alzhrani R，et al.PD-1 and PD-L1 Checkpoint Signaling Inhibition for Cancer Immunotherapy：Mechanism，Combinations，and Clinical Outcome[J].Front Pharmacol，2017，8：561.

[39] Tang ZS，Hao YH，Zhang EJ，et al.CD28 family of receptors on T cells in chronic HBV infection：Expression characteristics，clinical significance and correlations with PD-1 blockade[J].Mol Med Rep，2016，14（2）：1107-1116.

[40] Balsitis S，Gali V，Mason PJ，et al.Safety and efficacy of anti-PD-L1 therapy in the woodchuck model of HBV infection[J].PLoS One，2018，13（2）：e190058.

[41] Qiu SJ，Zhou ZG，Shen F，et al.A multicenter，randomized，observation-controlled clinical trial to evaluate the efficacy and safety of thymalfasin adjuvant therapy in patients with HBV-related HCC after curative resection- first announcement of the protocol[J].Expert Opin Biol Ther，2015，15 Suppl 1：S133-S137.

[42] 李春柱，曹世敏，胡麗华.胸腺肽α-1联合恩替卡韦对慢性乙型肝炎患者肝功能及血清HBeAg转阴率的影响[J].中国地方病防治杂志，2018，33（5）：577-578.

[43] Naylor PH，Mutchnick MG.Immunotherapy for hepatitis B in the direct acting antiviral era：Reevaluating the thymosin alpha1 efficacy trials in the light of a combination therapy approach[J].J Viral Hepat，2018，25（1）：4-9.

[44] Li J，Bao M，Ge J，et al.Research progress of therapeutic vaccines for treating chronic hepatitis B[J].Hum Vaccin Immunother，2017，13（5）：986-997.

[45] King TH，Kemmler CB，Guo Z，et al.A whole recombinant yeast-based therapeutic vaccine elicits HBV X，S and Core specific T cells in mice and activates human T cells recognizing epitopes linked to viral clearance[J].PLoS One，2014，9（7）：e101904.

[46] Zhu D，Liu L，Yang D，et al.Clearing Persistent Extracellular Antigen of Hepatitis B Virus：An Immunomodulatory Strategy To Reverse Tolerance for an Effective Therapeutic Vaccination[J].J Immunol，2016，196（7）：3079-3087.

（收稿日期：2019-03-27 修回日期：2019-04-13）