张慧慧，卢建媚

(广州百花香料股份有限公司，广州 510660)

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)俗称河蟹、毛蟹、螃蟹、大闸蟹，是我国一项名贵的水产资源，也是主要的养殖经济蟹类。其肉质细嫩， 味道鲜美，营养丰富[1，2]。随着人工养殖蟹技术的发展和成熟，河蟹产量持续稳定增长。虽然蟹类产品加工历史悠久，但是加工方式一般只有腌制(醉蟹)、干制(蟹肉松)、灌装、速冻等[3]。并且河蟹在生产加工过程中，会产生蟹壳、蟹腿等大量废弃物，导致产品利用率低，附加值下降。为了提高产品的技术含量和附加值，利用现代生物酶解技术深度酶解河蟹蛋白质，产生氨基酸、小分子多肽等，将其加工成蟹味调味料或者蟹味香精，既可以提高废弃物的附加值，也可以解决污染和浪费问题。

热反应型肉味香精具有香气自然、醇厚逼真、成本低等优点，越来越受到食品厂商及消费者的喜爱，市场份额及发展空间也越来越大[4]。为了进一步研究蟹肉香精，本文以河蟹为原料，采用生物酶解技术制备蟹肉酶解液，再经过Maillard反应制备蟹肉风味香精。采用顶空-固相微萃取和气相色谱-质谱连用技术(HS-SPME-GC-MS)分别对河蟹酶提取物和Maillard蟹肉香精挥发性成分进行萃取和鉴定，旨在为蟹肉香精的开发提供理论基础和依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

河蟹：市售；木瓜蛋白酶：华琪生物科技有限公司；风味蛋白酶：诺维信(中国)生物技术有限公司；葡萄糖、木糖：均为食品级；酵母抽提物(YE)；水解植物蛋白(HVP)；L-半胱氨酸盐酸盐一水物、甘氨酸、精氨酸、维生素B1、牛磺酸：均为食品级。

1.2 实验仪器

电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司；绞肉机 广州新域机电制造有限公司；TC-15恒温电加热套 巩义市予华仪器有限责任公司；强力电动搅拌机 上海标本模型厂；三口烧瓶 江苏华鸥玻璃有限公司；冷凝回流管 江苏好奇教学仪器有限公司；7890B-5977B MSD气相色谱-质谱联用仪、HP-5MS UI色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm) Agilent 科技有限公司；固相微萃取装置(SPME) 美国Supelco公司。

1.3 蟹肉酶解液的制备

将河蟹用水清洗、切块、绞碎，蟹肉与水的比例为3∶1，加入酶(木瓜蛋白酶的用量为0.35%，风味蛋白酶的用量为0.15%)进行酶解，酶解温度60 ℃，酶解时间3 h，升温至90 ℃以上灭酶，过60目筛网，得滤液。

1.4 Maillard蟹肉香精的制备

取80 g酶解液，加入6 g葡萄糖、1.5 g木糖、1 g L-半胱氨酸盐酸盐一水物、2 g甘氨酸、0.5 g精氨酸、0.5 g牛磺酸、0.5 g维生素B1、38 g水、5 g酵母抽提物、5 g水解植物蛋白，加入反应釜中，102 ℃反应60 min，制得蟹肉香精。

1.5 顶空-固相微萃取(HS-SPME)条件

称取酶解液/香精5 mL于萃取瓶中，加入磁力转子，在磁力搅拌装置中于55 ℃水浴加热0.5 h。将已经老化好的带75 μm CAR/PDMS涂层的萃取头(250 ℃老化0.5 h)插入萃取瓶中。在样品上方悬空，于55 ℃吸附1 h。静止冷却后于进样口解吸3 min后进行GC-MS分析。

1.6 气相色谱-质谱联用分析(GC-MS) 条件

1.6.1 GC条件

用氦气作载气，流速为1 mL/min；分流比为120∶1；HP-5MS色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)；升温程序：色谱柱起始柱温50 ℃，保持3 min，以2 ℃/min升至180 ℃，随后以20 ℃/min升至300 ℃，保持10 min；进样口温度250 ℃。

1.6.2 MS条件

电离方式为EI，离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；传输线温度300 ℃；电子能量70 eV；扫描质量范围29～550 amu；扫描方式为全扫描；调谐方式为自动调谐。

1.7 数据分析

1.7.1 定性分析

挥发性物质的鉴定结果根据W8N08谱库检索和自建香料库。本研究中，将谱库中化合物匹配度低于70(最大值为100)的组分标为未鉴定出。

1.7.2 定量分析

利用Excel数据处理软件，扣除色谱图中的苯乙腈等非嗅感杂峰，计算挥发性风味物质的总峰面积；每个样品测定2次，求平均值，采用峰面积归一化法确定各挥发性成分的相对含量。

1.8 气味活度值的确定

采用气味活度值法(odor activity value, OAV)评价各挥发性成分对蟹肉香精总体风味的贡献，OAV=C/T(C为物质浓度或相对浓度，T为感觉阈值)。在一定范围内，OAV值越大说明该物质对总体风味贡献越大。

2 结果与分析

河蟹Maillard蟹肉香精的GC-MS分析图谱见图1。

图1 河蟹酶解液Maillard香精挥发性成分总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of river crab hydrolysate by Maillard reaction

保留时间(min)化合物感觉阈值[5](μg/kg)含量(%)OAV值11.7492-甲基吡嗪 2-methyl pyrazine 60～1050006.3828 0.1064 16.54462,5-二甲基吡嗪 2,5-Dimethyl pyrazine 800～180016.3628 0.0205

续 表

注：“-”表示无法检测出该物质的感觉阈值。

由表1中的GC-MS鉴定结果可知，共有24种挥发性风味成分被检测出，主要有醇类、醛类、酚类、硫醚类、杂环类(包括吡嗪、呋喃、噻唑、噻吩、吡咯)、其他等。单一组分中，含量最高的为苯甲醛(25.92%)、2,5-二甲基吡嗪(16.36%)、4-甲基-5-(β-羟乙基)噻唑(11.23%)、2,3,5-三甲基吡嗪(9.49%)、2-甲基吡嗪(6.38%)、2-乙酰基噻唑(4.48%)、苯乙醛(4.28%)、二甲基三硫醚(2.32%)等。

从OAV 值可以看出，对蟹肉香精香气贡献比较大的分别为：二甲基三硫醚(464.6)、β-紫罗兰酮(57.51)、3-甲硫基丙醛(11.29)、苯乙醛(1.071)、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(0.8053)、5-甲基-2-噻吩甲醛(0.6787)等。

醇类物质可能是脂肪酸的二级氢过氧化物的分解、脂质氧化酶对脂肪酸的作用、脂肪的氧化分解或由羰基化合物的还原生成的[6]。由于自身高阈值的特点，醇类化合物对食品风味的贡献较小，除非以高浓度存在或者是不饱和的。糠醇有特殊的苦辣香气，苯甲醇则具有芳香气味，文献报道是对蟹香味有贡献的化合物。

醛类、酮类主要是由多不饱和脂肪酸的热氧化或降解、氨基酸降解或者微生物氧化产生的，对香味的形成起到了修饰的作用[7，8]。醛类阈值通常比其他化合物低，具有青香、果香、坚果香和奶酪香等香气。酮类贡献于蟹等甲壳类水产品甜的花香和果香风味，并且具有较低的阈值。例如，苯甲醛具有苦杏仁、类似炒花生的香气，3-甲硫基丙醛低浓度时具有肉汤、海鲜香气。

杂环类化合物通常是Maillard反应的产物，包括呋喃、吡嗪、吡咯、噻唑、噻吩等。这些物质大多数以较低的浓度存在，多数具有肉香、烤肉香、焦香和坚果香等。呋喃类化合物通常是还原糖-氨基酸的相互作用、Amadori和Heyns中间体的降解、糖或硫胺素热降解的产物，有似焦糖味、坚果味、肉味、水果味，具有增香的作用[9]。吡嗪类化合物一般具有烤香和坚果香，通过Maillard反应和Strecker热降解生成，风味阈值较低[10]。例如，2,5-二甲基吡嗪会呈现较强的果仁香气。噻吩类化合物主要是含硫氨基酸、或者含硫氨基酸与葡萄糖或木糖的热降解产生的，是在Maillard反应的前期阶段生成的，高温是形成噻吩类物质的先决条件，噻吩类化合物风味特征比较明显，对肉的总体风味具有基本的贡献，如在蟹肉香精中鉴定出的5-甲基-2-噻吩甲醛。噻唑类物质一般是通过半胱氨酸的热降解、或者含硫氨基酸与羰基化合物相互作用、或者硫胺素的热降解产生的。一般气味强烈，阈值低，如2-乙酰基噻唑具有坚果、谷物香和爆米花般的香气。吲哚，又称苯并吡咯，具有极强的挥发性，通常具有恶臭味、排泄物气味。

硫醚通常来源于含硫化合物或不饱和脂肪酸，含硫化合物阈值较低，如二甲基三硫醚，通常影响食品的整体芳香。

3 结论

采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)联用的方法，从蟹肉香精中共检测出24种挥发性香气成分，包括醇类、醛类、酚类、硫醚类、杂环类(包括吡嗪、呋喃、噻唑、噻吩、吡咯)、其他等，含量最高的分别为吡嗪类、醛类。单一组分中，含量最高的为苯甲醛(25.92%)、2,5-二甲基吡嗪(16.36%)、4-甲基-5-(β-羟乙基)噻唑(11.23%)、2,3,5-三甲基吡嗪(9.49%)、2-甲基吡嗪(6.38%)、2-乙酰基噻唑(4.48%)、苯乙醛(4.28%)、二甲基三硫醚(2.32%)等。

通过OAV值分析，结果表明对蟹肉香精香气有突出贡献的为：二甲基三硫醚(464.6)、β-紫罗兰酮(57.51)、3-甲硫基丙醛(11.29)、苯乙醛(1.071)、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪(0.8053)、5-甲基-2-噻吩甲醛(0.6787)等。

通过河蟹酶解液Maillard反应制备的蟹肉香精，香气醇厚，烤香浓郁，肉香自然，对其香气成分进行分析和鉴定，可以了解其香气组成，为蟹肉香精的开发提供了理论依据和基础。