章银良，李鑫，蔡亚玲

(1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，郑州 450001；2.食品生产与安全河南省协同创新中心，郑州 450001)

防腐剂(Preservative)是指天然或合成的能够杀灭或抑制微生物生长和化学变化引起的腐败的物质[1]。通常根据防腐剂的来源可以将其分为天然防腐剂和化学防腐剂两大类[2,3]。其主要是通过破坏微生物正常的新陈代谢，使微生物蛋白质凝固和变性，抑制其体内的酶类和代谢产物的排除，导致其失活，因此其被广泛应用于肉类、油脂、火腿、方便面等食品中。目前，在食品防腐保鲜过程中，主要添加的是化学防腐剂，但是由于化学防腐剂的使用不当所引起的致癌、致畸、食品中毒等问题频发，以及消费者对食品安全问题的关注程度日益高涨，所以探索抑菌效果好、无毒性的天然防腐剂成为食品领域研究的热点问题之一[4-7]。

为了避免使用合成防腐剂，近年来，许多研究者已开发出一些天然提取物，如：精油、香酚乙酸酯、丁香酚、乳酸链球菌素(Nisin)、溶菌酶、纳他霉素等[8-12]。尽管低浓度的溶菌酶、纳他霉素和精油在体外研究中是有效的，但在食物基质中需要更高的浓度以达到相当的效果，并且它们的抗菌广谱性较受限制[13]。

此外，精油的使用会对腌制食品的风味产生很大影响[14]。与此同时，一些研究人员探索发现了具有抗微生物作用的美拉德反应产物(MRPs)也可作为天然防腐剂，当羰基化合物如还原糖与游离或蛋白质结合的氨基酸反应时会形成MRPs，例如在牛奶或烘焙产品的热加工过程中或在咖啡或可可豆的烘焙过程中[15]。

近年来，已经研究了来自模型混合物(氨基酸和还原糖的加热溶液)或来自食物提取物的MRPs的抗微生物作用。因此，检测到来自模型混合物的MRPs对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌、嗜水气单胞菌或幽门螺杆菌等不同菌株的抗菌活性以及针对酵母的抗菌活性[16-18]。

本文主要将MRPs与2种化学防腐剂山梨酸钾、双乙酸钠及3种天然防腐剂乳酸、乳酸钠、Nisin(乳酸链球菌素)进行对比研究，以评估它们在抑菌广谱性、抗微生物活性方面的优劣差别。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-赖氨酸、D-果糖、L-精氨酸、D-葡萄糖：生化试剂，Solarbio试剂公司；山梨酸钾、双乙酸钠、乳酸钠、乳酸、Nisin(乳酸链球菌素)：食品级，山东优索化工科技有限公司；蛋白胨、氯化钠、酵母粉、琼脂：北京奥博星生物技术有限公司；氢氧化钠、盐酸、无水乙醇：分析纯，国药集团有限公司；去离子水。

1.1.1 指示菌

细菌：枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisBNCC188080)、大肠杆菌(Trans·T1、Top10、BL21)；真菌：酵母菌(MQ3-23、MQ1-23、MQ3-21、MQ3-18)、酿酒酵母(SaccharomycescarlsbergensisACCC20032)。

以上9种受试菌株均来自本实验室。

菌悬液的制备：细菌在37 ℃下摇床培养约2 h，真菌在28 ℃下摇床培养约4.5 h，得到浓度为(1.0～5.0)×106CFU/mL的菌液。

1.1.2 指示菌培养基

YPD培养基：蛋白胨2%，酵母粉1%，葡萄糖2%，琼脂1.5%～2%。

LB培养基：NaCl 1%，蛋白胨1%，酵母粉0.5%，琼脂1.5%～2%。

1.2 仪器与设备

牛津杯(内径6.0 mm，外径8.0 mm，高10.0 mm)；检测专用培养皿(内径90 mm，高15 mm)；美国Rainin瑞宁Pipet-Lite XLS移液枪 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；YZJ-SCT121超净工作台 东莞市华旗净化工程有限公司；SQP电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；DNP-9162BS电热恒温培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；HJ-3恒温磁力加热搅拌器 常州国华电器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅 广州越特科学仪器有限公司；pH计 瑞士梅特勒-托利多公司；T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；HH-1智能型数显恒温油浴槽 巩义市予华仪器有限责任公司；101-2型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 抑菌效果最佳的MRPs制备

依据前期均匀试验以及单因素试验比较分析优化得出制备MRPs的最佳反应条件和反应原料。参考章银良等[19]的方法，准确称取D-葡萄糖3.6032 g和L-精氨酸10.4520 g(摩尔比1∶3)，溶解于90 mL的去离子水中，置于恒温磁力搅拌器上搅拌至溶液清澈，再用3 mol/L的HCl和3 mol/L的NaOH调整溶液pH至12.0，最后将调好的pH值为12.0的溶液定容至100 mL，混合均匀后，取10 mL反应液转移到25 mL具塞试管中，旋紧试管后，置于120 ℃恒温油浴锅中反应210 min，反应结束后置于冰水中冷却。再准确称取D-果糖10.8096 g和L-赖氨酸2.9238 g(摩尔比3∶1)溶解于90 mL的去离子水中，制备条件为加热时间90 min、反应初始pH值调至10.0、温度120 ℃，其余制备步骤同上。

1.3.2 MRPs与不同种类防腐剂抑菌效果的研究

1.3.2.1 牛津杯法测定抑菌活性

参考Makhlouf-Gafsi I等[20]、张建华等[21]的方法，在无菌条件下，将经过高压蒸汽灭菌的固体培养基(真菌用YPD培养基，细菌用LB培养基)冷却至40～45 ℃之间，倒6组平板，每组9个。取40 μL浓度为(1.0～5.0)×106CFU/mL的菌液转移至固体培养基平板表面并用无菌涂布棒涂布均匀。用移液枪分别吸取MRPs、乳酸、山梨酸钾、双乙酸钠、乳酸钠、Nisin(防腐剂浓度均按国标最大限量配制)各200 μL加入摆放于固体培养基中央的牛津杯内(细菌加入果糖和赖氨酸MRPs，酵母菌加入葡萄糖和精氨酸MRPs)，同时做试剂空白对照。放入恒温培养箱中平板倒置培养，测量抑菌圈直径，并计算3次平行试验的平均值。

1.3.2.2 抑菌率的测定

参照杨晓韬等[22]、顾胜等[23]的方法，首先将5种防腐剂分别按国标最大限量的100%进行配制，用无菌水配制并且都在无菌操作台中操作。在含有5 mL液体培养基的试管中，实验组加入200 μL防腐剂溶液、40 μL菌悬液；阳性对照组用无菌水代替防腐剂，阴性对照组只加入液体培养基和防腐剂(用比浊法调零，菌落总数法只做阳性对照)。

菌落总数法[24]：用于乳酸、MRPs、Nisin抑菌活性的测定。用稀释不同浓度梯度(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)的菌悬液分别制备上述混合液，之后各取200 μL涂平板，真菌于28 ℃下培养48 h，细菌于37 ℃条件下培养24 h，计数，与阳性对照比较，并用于表征各种防腐剂的抑菌活性。

比浊法[25]：用于山梨酸钾、双乙酸钠、乳酸钠抑菌活性的测定。将上述体系充分混匀后，真菌于28 ℃下培养48 h，细菌于37 ℃下培养24 h。取出试管，充分振荡，并对各个试管进行逐一检查，观察每个试管的浑浊度。以阴性对照作为空白参比，用紫外分光光度计于适宜波长处(真菌培养液在560 nm处测量，细菌培养液在600 nm处测量)测定培养液的浊度(OD 值)，与阳性对照比较，并用于表征各种防腐剂的抑菌活性。

菌落总数法抑菌率的计算：

抑菌率(%)=(1-实验组菌落数/阳性对照菌落数)×100。

(1)

比浊法抑菌率的计算：

抑菌率(%)=(1-实验组OD值/阳性对照OD值)×100。

(2)

1.3.2.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定

MIC的测定[26,27]：首先根据防腐剂5种水平添加量(国标限量的0%、20%、40%、60%、80%、100%)的抑菌率初步确定其MIC范围，在此百分比下设定密集的稀释浓度梯度(稀释2，4，8，16，32，64，128，256，512，1024倍)，培养后涂布平板测定其菌落总数，选择无菌落生长(即抑菌率为100%)时的防腐剂质量浓度，即为防腐剂的最小抑菌浓度(MIC)。

2 结果与分析

2.1 牛津杯法测定抑菌活性结果对比

以抑菌圈直径作为抑菌活性指标，测定MRPs与不同种类的防腐剂(天然防腐剂与化学防腐剂)对不同菌种的抑制效果，分别用SPSS 19.0软件进行数据处理，试验结果见表1和表2。

表1 MRPs与防腐剂对不同真菌的抑菌圈直径

注：表中“-”表示抑菌圈直径Φ≤8 mm，无明显抑菌作用；同一行中，不同字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示差异不显著(p>0.05)。

表2 MRPs与防腐剂对不同细菌的抑菌圈直径Table 2 The inhibition zone diameters of Maillard reaction products and preservatives to different bacteria

注：表中“-”表示抑菌圈直径Φ≤8 mm，无明显抑菌作用；同一行中，不同字母表示差异显著(p<0.05)，相同字母表示差异不显著(p>0.05)。

经过方差分析和多重比较，观察对5种真菌的抑菌效果，由表1可知6种防腐剂对5种酵母菌的抑菌作用大小为：山梨酸钾>葡萄糖+精氨酸MRPs>乳酸>乳酸钠>双乙酸钠>Nisin，其中，葡萄糖+精氨酸MRPs仅次于山梨酸钾，对MQ3-21、MQ3-23、MQ3-18、MQ1-23、酿酒酵母的抑菌圈直径分别达到(22.76±0.25)，(20.25±0.18)，(20.56±0.54)，(23.89±0.71)，(21.55±0.36) mm，可以看出MRPs拥有能与化学防腐剂相媲美的抑菌效果，同时在抑菌广谱性方面又优于天然防腐剂乳酸钠；乳酸和乳酸钠2种防腐剂对MQ3-21、MQ3-23、MQ3-18、MQ1-23的抑菌效果有差异但不明显，但对于酿酒酵母的抑菌效果相差较大，乳酸对其抑菌圈直径达到(28.42±0.23) mm，而乳酸钠对其无明显抑菌作用。

另外，由表2观察对4种细菌的抑菌效果，可以得出6种防腐剂对4种细菌的抑菌作用大小为：双乙酸钠、乳酸>山梨酸钾>果糖+赖氨酸MRPs>乳酸钠>Nisin，果糖+赖氨酸MRPs的抑菌作用居中，对Trans·T1、Top10、BL21、枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别达到(20.49±0.22)，(21.63±0.41)，(23.82±0.37)，(20.05±0.28) mm，可见对4种细菌的抑菌强度较为均匀，其中Nisin的抑菌效果最弱，可能是由于Nisin在中性条件下溶解度太小，仅达到49.0 mg/mL，从而在牛津杯试验中形成的少量沉淀影响了它在培养基中的扩散。

2.2 MRPs与不同防腐剂对不同菌株的抑菌率差异

以抑菌率为抑菌活性指标，美拉德反应产物与不同种类的防腐剂在不同添加量下对9种供试菌株的抑菌率见图1和图2。

图1 MRPs与不同防腐剂对不同真菌的抑菌率Fig.1 The inhibition rates of MRPs and different preservatives on different fungi

图2 MRPs与不同防腐剂对不同细菌的抑菌率Fig.2 The inhibition rates of MRPs and different preservatives on different bacteria

由图1可知，6种防腐剂对5种酵母菌的抑菌率大小为：山梨酸钾>乳酸>双乙酸钠>葡萄糖+精氨酸MRPs>乳酸钠>Nisin。其中山梨酸钾对MQ3-21和酿酒酵母这2株菌的抑菌率都为100%；双乙酸钠和乳酸2种防腐剂对MQ3-23、MQ3-18、MQ1-23这3株菌的抑菌效果有差异但不明显，抑菌率相差不超过6%；葡萄糖+精氨酸MRPs对5株菌的抑菌效果相差较大，对MQ1-23的抑菌率达到52%，对MQ3-21的抑菌率为32%，而对酿酒酵母的抑菌率只有17%，对MQ3-23、MQ3-18的抑菌率不足10%；而国标限量下的Nisin对5株菌均无抑制作用。

同时，由图2可知，6种防腐剂对4种细菌的抑菌率大小为：乳酸>Nisin>双乙酸钠>果糖+赖氨酸MRPs>乳酸钠>山梨酸钾。乳酸对这4株细菌的抑菌率均达到100%；Nisin对各菌株的抑菌率仅次于乳酸；乳酸钠对4株菌的抑菌率相差较大，它对BL21和枯草芽孢杆菌的抑菌率达到了80%和95%，而对Trans·T1、Top10的抑菌率不到2%；果糖+赖氨酸MRPs与双乙酸钠的抑菌效果相似，且它们的抑菌效果都优于山梨酸钾。

2.3 最小抑菌浓度(MIC)法测定结果分析

按照1.3.2.3所述试验方法及步骤，采用二倍连续稀释法测定MRPs与5种防腐剂分别对9种常见腐败菌的最小抑菌浓度(MIC)，结果见表3和表4。

表3 MRPs对供试菌的最小抑菌浓度Table 3 The minimal inhibitory concentration of MRPs to tested strains

注：“-”表示无供试菌生长；“+”表示有供试菌生长； 9号试管为阴性对照；10号试管为阳性对照。

表4 5种防腐剂对供试菌的最小抑菌浓度Table 4 The minimal inhibitory concentration of five preservatives on tested bacteria mg/mL

注：“-”表示防腐剂最终质量浓度达到50 mg/mL 时仍不能完全抑菌。

由表3和表4可知，MIC值越低，即相应食品防腐剂的抑菌作用越强。Nisin对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌有很强的抑菌作用，在5种防腐剂中，它的最小抑菌浓度与双乙酸钠相同，都是最小的，但是对于革兰氏阴性的3种大肠杆菌，它的抑菌效果却不明显；且对以上5种酵母菌皆无抑菌作用，这与吕淑霞等[28]的研究结果一致。乳酸对革兰氏阳性菌的最小抑菌质量浓度虽然比Nisin和山梨酸钾略大，但远优于乳酸钠，尤其是对3种革兰氏阴性菌Top10、BL21和Trans·T1的最低抑菌质量浓度是最小的。山梨酸钾对5株酵母菌的最小抑菌质量浓度明显低于其他防腐剂，而它对4株细菌的抑菌效果一般，分析其原因可能有以下几个方面：山梨酸钾对霉菌、酵母和好气性菌均有抑制作用，但对嫌气性芽孢形成菌与嗜酸乳杆菌则几乎无效[29]，即山梨酸钾并不是广谱的防腐剂；对比可以看出双乙酸钠的抑菌广谱性较好，而乳酸钠对细菌的抑菌效果在5种防腐剂中最差。

各防腐剂的最低抑菌质量浓度综合排序：对于细菌，乳酸<双乙酸钠<山梨酸钾

3 结论

本实验用抑菌圈、抑菌率、最小抑菌浓度3个指标来检测MRPs、山梨酸钾、Nisin等7种食品防腐剂对食物中常见细菌和真菌的抑制效果，结果表明7种防腐剂对各种供试菌都有不同程度的抑菌效果，防腐剂质量浓度越高，其抑菌效果越好。总体来看，7种防腐剂对于真菌的抑菌作用强弱为：山梨酸钾>乳酸>双乙酸钠>葡萄糖+精氨酸MRPs>乳酸钠>Nisin；对细菌的抑菌作用强弱为：乳酸>双乙酸钠>山梨酸钾>果糖+赖氨酸MRPs>Nisin>乳酸钠。同一种防腐剂，特别是抑菌效果中等的防腐剂，不仅对不同种的细菌抑菌效果不同，而且对于同种不同株的细菌，其抑菌效果也不尽相同，甚至相差很大。因此，对于防腐剂的抑菌效果，不能单纯以菌种来定论，应具体到所涉及的每一株菌。对于大多数供试菌而言，山梨酸钾、双乙酸钠、乳酸的抑菌效果最好。而2种MRPs的抑菌作用虽略低于化学防腐剂，但是优于乳酸钠和Nisin 2种天然防腐剂，且抑菌广谱性也优于其余几种防腐剂。随着人们生活和消费水平的提高，人们对食品安全提出了更高的要求，食品防腐剂的开发与使用为了顺应市场的变化，其产品也越来越趋向“绿色”和“天然”等方向转变，本实验也进一步证明了MRPs作为食品防腐剂比生物防腐剂更高效，比化学防腐剂更广谱。因此，天然、安全的MRPs防腐剂将是未来食品防腐领域研究的重点。