夏莎莎，张 梓，夏瑞祥

多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是浆细胞单克隆性增殖的恶性肿瘤，目前尚无根治方法。CD137配体(CD137 ligand，CD137L)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)超家族成员，在多种肿瘤细胞中发挥重要作用[1-3]。CD137 / CD137L在抗原提呈细胞表面，起双向信号传导作用，CD137L介导的逆向信号促进TNF分泌而抑制白介素10(interleukin- 10，IL- 10)分泌[4]。其中，IL- 10被认为能调节免疫细胞的分化及生长，抑制免疫细胞的活化[5]。应用抗CD137L抗体阻断T细胞CD137-137L信号途径，II类细胞因子IL- 10表达增高[6]。 研究[7]还显示，IL- 10即可抑制机体的免疫功能从而促进肿瘤细胞免疫逃逸，也能直接促进肿瘤细胞增殖。该研究通过调节MM细胞内CD137L基因表达，探究其对IL- 10的分泌和MM细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂RPMI1640培养液购自美国Hyclone公司；胎牛血清、胰酶均购自美国Gibco公司；逆转录试剂盒购自美国Thermo Scientific 公司；TB Green qPCR Master Mix试剂盒购自日本Takara公司； β- actin抗体购自美国BD公司；鼠抗人IgG单克隆抗体购自美国eBioscience公司；定制的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)购自德国凯基生物公司；TRIzol购自美国Invitrogen公司；鼠抗人CD137L单克隆抗体、人CD138微磁珠购自德国miltenyi生物公司。

1.2 标本采集收集2017年3月～2018年3月安徽医科大学第一附属医院血液科收治的16例MM患者，所有患者的诊断均符合《中国多发性骨髓瘤诊治指南(2017年修订)》[8]。选择14例血小板轻度减少、骨髓象正常的患者作为实验对照组。按照人CD138磁珠(德国miltenyi公司)分选说明书的操作，分离出浆细胞。本研究已获得本院医学伦理委员会批准，所有实验对象及家属均已签订知情同意书。

1.3 细胞培养及siRNA转染人MM 细胞株U266细胞采用细胞悬浮培养，按2.5×105个/孔铺于6孔板中，配制转染体系：分别将4种150 ng siRNA溶于200 μl含血清培养基中，再加入12 μl Hiperfect，均匀混合后加入6孔板。

1.4 Western blot方法检测CD137L蛋白相对表达量采用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度。30 μg样品经SDS- PAGE凝胶电泳后转至PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉封闭液室温封闭2 h，TBST洗涤3次，相应一抗(CD137L抗体：德国miltenyi生物公司；β- actin：美国BD公司)孵育过夜，TBST洗3次后，加入二抗室温孵育2 h，TBST洗3次，ECL发光法曝光、显影，用Image Pro plus分析软件分析各条带灰度值。

1.5 RNA提取、逆转录及RT- PCR法检测CD137L mRNA相对表达量通过Trozel法提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒(美国Thermo Scientific 公司)操作方法将 mRNA 逆转录成 cDNA，按照qPCR试剂盒(日本Takara公司)说明配制反应体系。以β- actin为内参，计算出CD137L mRNA相对表达量。

1.6 共培养及ELISA法检测IL- 10的分泌水平采用密度梯度离心分离骨髓单个核细胞，培养3 d后去悬浮细胞后即得骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，按2×104个/ml接种于6孔板，4 h弃上清液，备用。按下列方法设置4组。A组：MM细胞株U266单独培养；B组：BMSCs单独培养；C组：未转染的MM细胞株U266与BMSCs共培养即(U266- siRNA- 0+BMSCs)；D组：转染编号为2的siRNA处理后的MM细胞株U266与BMSCs共培养即(U266- siRNA- 2+BMSCs)，24 h后收集上清液并使用Human IL- 10 ELISA Kit测各组IL- 10的分泌水平。

1.7 CCK8法检测细胞增殖情况细胞经处理后，加入10% CCK8溶液，继续培养2 h后用酶标仪测出波长为450 nm的吸光度值(A450)，绘制细胞生长曲线。

2 结果

2.1 CD137L在MM患者的浆细胞中呈现高表达MM组患者骨髓血中浆细胞的CD137L蛋白表达(1.96±0.51)明显高于对照组(1.00±0.29)，差异有统计学意义(t=6.460，P<0.001)。见图1。

图1 两组患者骨髓血浆细胞CD137L蛋白表达水平

1、2： 非血液疾病患者；3、4：MM患者；与对照组比较：***P<0.001

2.2 CD137L基因沉默后mRNA表达明显下降在转染后不同时间，4条siRNA分别与对照组相比较，均可明显下调U266细胞上CD137L mRNA表达水平，差异有统计学意义(B：t=10.281,P=0.005；C：t=21.439,P=0.001；D：t=4.509,P=0.022；E：t=16.615,P=0.002)。见图2。

图2 siRNA沉默CD137L基因后mRNA表达水平

A：siRNA对照组；D～E：CD137L特异性siRNA；与siRNA对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

2.3 下调U266细胞的CD137L表达可促进IL- 10的分泌下调U266细胞内CD137L表达可促进共培养上清液中IL- 10的分泌，差异有统计学意义(t=14.732，P<0.01)。见表1。

表1 沉默CD137L基因对U266、BMSCs

与U266- siRNA- 0+BMSCs组比较：**P<0.01

2.4 沉默CD137L基因促进U266细胞增殖与对照组(siRNA- 0)相比较，沉默组(siRNA- 2)U266细胞在72 h后增殖明显加快，差异有统计学意义(t=4.730，P=0.021)。见图3。

图3 siRNA沉默CD137L基因对U266细胞增殖的影响

siRNA- 0： 对照组；siRNA- 2：CD137L特异性siRNA；与对照组比较：*P<0.05

3 讨论

MM是一种终末未分化的恶性肿瘤[9]。目前MM已成为发病率排名第2的血液系统肿瘤，虽然硼替佐米等蛋白酶体抑制剂、单克隆抗体、免疫调节及自体造血干细胞移植术广泛用于MM的治疗，显著改善了MM患者的预后，但至今未有彻底治疗的方法[10]。CD137/CD137L介导的逆向信号能促进单核细胞释放巨噬细胞集落刺激因子从而影响细胞因子IL- 2、IL- 6、IL- 8、IL- 10等的分泌，其中IL- 10是作用机制十分复杂的肿瘤免疫抑制因子。IL- 10能作为自分泌或旁分泌生长因子促进肿瘤细胞生长，并能抑制细胞程序死亡，调节宿主微环境,影响肿瘤的转移[11-13]。本实验用4种siRNA转染MM细胞株U266降低其表面CD137L的表达，U266在骨髓微环境下IL- 10分泌水平上升，U266细胞增殖加快，这提示CD137L在MM中可通过抑制IL- 10的分泌影响MM的增殖。Gullo et al[14]研究显示CD137L分子在MM中呈现高表达，激活CD137L逆向信号可以促进炎性因子IL- 6和IL- 8的分泌，从而促进MM细胞的凋亡。同时，有研究[15]表明IL- 10参与了B细胞向浆细胞分化。本实验以MM患者及非血液系统疾病患者的骨髓血为标本，验证CD137L分子高表达于MM患者的浆细胞。在MM中CD137L是IL- 10分泌的抑制蛋白，CD137L的逆向信号在MM中的作用抑制IL- 10的分泌影响机体免疫调节，利用CD137L作为靶点研究对于疾病的治疗可能具有十分重要的临床意义。