庞 欣，张建伟，韩佳瑞，王学敏，魏浏佳

系膜增生性肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis, Ms PGN)主要症状为不同程度的系膜基质增多及弥漫性肾小球系膜细胞增生[1]。根据国内大量临床病理资料表明，Ms PGN是我国常见的原发性肾小球疾病[2]。丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)作为丹参最主要提取成分和活性成分,是一种水溶性化合物(分子式为C36H30O16，相对分子质量：718.62)[3]。SAB具有减轻局部缺血损伤的功效[4]和抗凋亡作用，SAB在大鼠大脑皮质神经细胞中通过降低细胞外Ca2+浓度和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶- 3(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase- 3)活性，能提高线粒体能量代谢和抗氧化能力从而保护细胞不被凋亡[5]。在Ms PGN中涉及细胞炎症和凋亡的通路众多，但临床上有关SAB的治疗及作用机制还是极少报道。该研究探讨SAB对大鼠Ms PGN模型的治疗效果和作用机制，期望为Ms PGN的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试剂Click- iT® Plus 缺口末端标记(TdT- mediated dUTP Nick- End Labeling, TUNEL)试剂盒(货号：C10618)购自美国Invitrogen公司。苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(货号：C0105)购自上海碧云天生物技术有限公司。Caspase- 3(货号：ab13847)、Bcl- 2相关的X蛋白(Bcl- 2- associated X protein，Bax)(货号：ab53154)、B淋巴细胞瘤- 2(B- cell lymphoma- 2，Bcl- 2)(货号：ab692)、核因子κB p65(nuclear factor kappa- B p65，NF- κB p65)(货号：8242)、甘油醛- 3- 磷酸脱氢酶(glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase，GAPDH)(货号：1056)、肿瘤坏因子- α(tumor necrosis factor- α，TNF- α)(货号：11948)一抗购自美国abcam公司，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗小鼠二抗购自美国Santa Cruz公司。白细胞介素- 1β(interleukin- 1β，IL- 1β)(E- EL- M0037c)、IL- 6(货号：E- EL- R0015c)和IL- 18(货号：E- EL- R0015c)等ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特(Elabscience)生物科技股份有限公司。

1.2 仪器PCR仪、电泳仪及半干转膜仪均购自美国伯乐公司。Gel View 6000化学发光凝胶成像系统购自广州云星仪器有限公司。Multiskan GO酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3 实验方法

1.3.1改良慢性血清病法复制Ms PGN大鼠肾功能损伤模型及药物治疗方式 选择40只3周龄SPF级别SD大鼠，体质量(250±50)g，购自北京维通利华实验动物公司，许可证号为SYXK(京)2014- 0001，合格证号：0015675。大鼠饲养于无菌环境中，温度26～28 ℃，湿度50%～60%，光照时间12 h，自由采食和饮水。适应性饲养1周后，将大鼠随机分为四组，分别设置健康对照组(control, Ctrl)组、SAB单独作用组(SAB组)、Ms PGN(100 mg/kg)组和Ms PGN+SAB (100 mg/kg)组。大鼠适应性饲养1周后，自正式实验第1天起经口灌服牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)400 mg/kg(4 ml/kg) 隔日1次，用蒸馏水配制BSA，灌胃直至第8周；于实验第1天经皮下分点注射完全弗氏佐剂0.2 ml(含BSA 2 mg)，第8天经皮下分点注射不完全弗氏佐剂0.2 ml(含BSA 2 mg)。于实验第8天和第15天，分别从尾静脉注射BSA 0.4 mg/kg体质量(配成无菌生理盐水溶液)各1次。建立Ms PGN大鼠模型。

1.3.2大鼠基本指标检测 SAB治疗结束后样本提取前，称量大鼠体质量，并检测尿蛋白、血清肌酐和尿氮含量。SAB治疗结束后样本提取前，称量大鼠体质量，并检测尿蛋白、血清肌酐和尿氮含量。

1.3.3HE染色 肾脏组织经福尔马林固定后，修剪脱水透明后进行石蜡包埋。切片后逐步经HE染色，脱水透明后封片观察。

1.3.4ELISA检测炎症因子 大鼠心脏取血1 ml，低温离心机4 000 r/min离心8 min，取出上清液供实验使用。具体检测步骤按照Elabscience公司提供的使用说明书进行。

1.3.5TUNEL检测细胞凋亡 具体制片同HE步骤，后期染色参照Invitrogen公司产品说明书进行。

1.3.6免疫组织化学法分析组织中抗原表达 取出肾脏组织后用PBS清洗8次，去掉坏死组织及血凝块。用4%多聚甲醛在4 ℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50%和70%酒精依次清洗。脱水，石蜡包埋。1% Triton- 100处理15 min，3% H2O2处理15 min。5%羊血清封闭30 min后依次孵育一抗和二抗。染色封片。

1.3.7Western blot检测细胞中蛋白表达 收集四组组织细胞，PBS清洗3次，用添加蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解，用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白。用BCA试剂盒检测总蛋白浓度。具体Western blot步骤按照abcam公司提供产品说明书进行。

2 结果

2.1 SAB改善Ms PGN大鼠肾功能指标SAB治疗大鼠Ms PGN模型后，各组之间体质量变化差异无统计学意义。与Ctrl组比较，SAB组大鼠尿蛋白(2.36±0.20) mg/24 h、血清肌酐(0.54±0.02) mg/dl和尿氮含量(16.20±2.60) mg/dl间无明显差异；Ms PGN组与SAB组比较，尿蛋白(38.20±6.02) mg/24 h、血清肌酐(1.10±0.16) mg/dl和尿氮指标(22.64±2.26) mg/dl均显著上升(F=376.01，P<0.001；F=183.19，P<0.001，F=83.57，P<0.001)；与Ms PGN组比较，Ms PGN+SAB组尿蛋白(18.26±2.62) mg/24 h、血清肌酐(0.68±0.08) mg/dl和尿氮指标(17.98±2.06) mg/dl均明显下调(P<0.05)。见图1。

2.2 SAB抑制Ms PGN肾小球细胞凋亡HE染色实验显示：与Ctrl组比较，SAB组大鼠肾小球细胞无系膜基质与系膜细胞增生，肾间质无炎症细胞浸润，提示SAB使用对大鼠体征没有明显的影响。与Ctrl组比较，Ms PGN组大鼠肾小球细胞间具有大量的系膜基质和系膜细胞增生，肾间质充满炎症细胞浸润，肾小管上皮细胞空泡化及颗粒样化，提示造模成功；与Ms PGN组比较，Ms PGN+SAB组大鼠肾小球细胞系膜基质和系膜细胞增生明显减少，炎症浸润细胞减少，病理损害较小。TUNEL染色实验显示：与Ctrl组比较，SAB组大鼠肾小球细胞没有明显凋亡现象；与Ctrl组比较，Ms PGN组大鼠肾小球细胞发生十分显著的凋亡现象(F=747.56，P<0.01)；与Ms PGN组比较，Ms PGN+SAB组大鼠肾小球细胞凋亡现象得到明显缓解(t=79.436，P<0.05)，见图2。

2.3 SAB降低肾小球细胞促凋亡因子表达免疫组化实验显示：SAB组与Ctrl组比较，肾小球组织中Caspase- 3表达水平无差异；Ms PGN组与SAB组比较，Caspase- 3表达水平显著上升(F=3718.79，P<0.01)；与Ms PGN组比较，Ms PGN+SAB组Caspase- 3表水平明显下调(F=10.254，P<0.05)。Western blot实验结果显示：SAB组与Ctrl组比较，肾小球组织中促凋亡因子Bax、凋亡抑制因子Bcl- 2及Bax/ Bcl- 2水平均无显著差异。Ms PGN组与SAB组比较，Bcl- 2明显下调，Bax及Bax/Bcl- 2显著上升(F=534.52，P<0.05)；与Ms PGN组比较，Ms PGN+SAB组Bcl- 2表达升高，Bax及Bax/Bcl- 2显著下降(F=8.37，P<0.05)。见图3。

图1 不同处理组大鼠基本指标测量

图2 HE/TUNEL染色鉴定肾小球细胞形态及凋亡水平×400
与Ctrl组比较：**P<0.01；与Ms PGN组比较：#P<0.05

图3 免疫组化及Western blot检测肾小球组织中凋亡相关因子表达水平(上排图为免疫组化染色 ×400)1：Ctrl组；2：SAB组；3：Ms PGN组；4：Ms PGN+SAB组;与Ctrl组比较：**P<0.01；与Ms PGN组比较：#P<0.05；与Ms PGN组比较：##P<0.01

图4 ELISA法检测血清中相关炎症因子表达水平

2.4 SAB降低血清中炎症因子表达ELISA检测血清中相关炎症因子IL- 1β、IL- 6和IL- 18结果显示：SAB组与Ctrl组比较，肾小球组织中相关炎症因子表达水平无差异；Ms PGN组与SAB组比较，各炎症因子表达水平显著上升(F=300.65，P<0.05；F=377.28，P<0.05；F=178.20，P<0.05)；与而相较于Ms PGN组比较，Ms PGN+SAB组各炎症因子表达水平下调(F=155.15，P<0.05；F=59.00，P<0.05；F=39.27，P<0.05)。见图4。

2.5 SAB降低肾小球组织凋亡诱导通路分子活性Western blot检测肾小球组织中NF- κB p65和TNF- α结果显示：SAB组与Ctrl组比较，NF- κB p65和TNF- α表达水平无差异；Ms PGN组与SAB组比较，NF- κB p65和TNF- α表达水平显著上升(F=77.54，P<0.05；F=308.48，P<0.05)；Ms PGN+SAB组NF- κB p65和TNF- α表达水平明显下调(F=14.81，P<0.05；F=28.69，P<0.05)。见图5。

3 讨论

Ms PGN的主要特点是肾小球细胞的过度增生和细胞外基质降解。肾小球细胞过度增生是肾小球硬化造成肾损伤最关键进程[6]。目前西医治疗Ms PGN的手段主要是激素、免疫抑制剂等，但至今仍然没有阐述清楚哪种药物更有效，且这些药物尚有自身毒副作用[7]。近年来，Ms PGN中医辨证论治用药取得了较好的临床疗效[8]。而SAB作为中药丹参最主要提取成分和活性成分，对心、脑、肝等器官均具有重要药理作用，但SAB对Ms PGN肾脏的作用并不清楚。本研究HE染色实验显示：与Ctrl组比较，SAB组大鼠肾小球细胞无系膜基质与系膜细胞增生，肾间质无炎症细胞浸润，提示SAB使用对大鼠体征没有明显的影响。与Ms PGN组比较，Ms PGN+SAB组大鼠肾小球细胞系膜基质和系膜细胞增生明显减少，炎症浸润细胞减少，病理损害较小。TUNEL染色实验显示：与Ctrl组比较，Ms PGN组大鼠肾小球细胞发生十分显著的凋亡现象(F=747.56，P<0.01)，见图2；与Ms PGN组比较，Ms PGN+SAB组大鼠肾小球细胞凋亡现象得到明显缓解(t=79.436，P<0.05)，见图2。

图5 Western blot检测各组肾小球组织中相关凋亡基因表达水平

1：Ctrl组；2：SAB组；3：Ms PGN组；4：Ms PGN+SAB组;与Ctrl组比较：*P<0.05；与Ms PGN组比较：#P<0.05

有文献[5,9]报道SAB可以通过降低细胞线粒体内钙浓度来降低Caspase- 3活性，来减少皮层神经元和肝细胞等的细胞凋亡。Tang et al[10]证明在大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞中，SAB可以抑制由淀粉状蛋白β肽引起的细胞凋亡。但是SAB对于Ms PGN的研究鲜有报道，在Ms PGN病理发生过程中，肾小球组织细胞中往往会伴随着严重凋亡现象，因此肾小球抗凋亡治疗将是临床研究关键节点。本研究结果不仅从TUNEL水平上证明了SAB治疗后肾小球细胞凋亡减少，同时Caspase- 3、Bax、Bax/Bcl- 2也发生显著下调；证实SAB可以有效降低肾小球细胞发生凋亡，预示着Ms PGN作用于大鼠之后可以有效抑制Ms PGN疾病大鼠肾小球细胞凋亡发生。

本研究同时检测到大鼠血清中炎症因子IL- 1β、IL- 6和IL- 8也发生了明显下调。表明SAB对于抑制体内炎症也发挥着重要作用。转录因子NF- κB在炎症和免疫应答、抗凋亡过程中具有重要作用[11]。p65是NF- κB的亚单位，并且是多种激酶磷酸化激活靶点，p65磷酸化过程在多种生物学功能中发挥着作用，如可以激活TNF- α来响应免疫应答。而另一方面TNF- α不但自身可以直接诱导细胞凋亡，还可以激活p65来响应下游炎症因子应答[12-13]。综合前人和本实验结果可以推测，在SAB对Ms PGN的治疗过程中，SAB既可抑制NF- κB- p65和TNF- α活性来降低炎症因子，还可以抑制Caspase- 3依赖的凋亡通路来抑制凋亡发生，从而达到保护心肌细胞的作用。

综上所述，本文首次通过实验证实SAB对Ms PGN有一定保护作用，通过降低NF- κB- p65/Bax和TNF- α活性，并抑制Caspase- 3依赖的细胞凋亡及降低细胞炎症因子释放来实现。本研究通过Ms PGN 损伤大鼠模型初步探究了SAB在大鼠治疗Ms PGN损伤方面具有相关性和可行性。但是SAB在体内发挥功能的信号通路比较复杂，需要进一步明确其相关信号转导机制并选择关键靶点分子才能为精准治疗系膜增生性肾炎提供指导。后续应该从SAB在大鼠体内药物代谢动力学等方面来进一步阐述SAB的作用效果；同时还应该针对不同物种进行相应的研究，以便更加清楚地探究SAB的作用机制。