黄 艳,涂勋良,马晓丽,王 进,吕秀兰,*

(1.四川农业大学果蔬研究所,四川成都 611130;2.四川省农业科学院园艺研究所,四川成都 610066;3.重庆三峡农业科学院,重庆 404155)

柠檬(Citruslimon(L.)Burman f.)是芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)枸橼类多年生常绿小乔木[1],周年多次开花、结果,是鲜食、加工兼用的高档水果,作为重要的天然香料和食品、工业原料,在食品、医药、化妆品、日用化工等行业均有广泛应用[2]。现全球柠檬种植主要分布于北美洲、拉丁美洲、亚洲、地中海沿岸等,我国为柠檬生产大国,主要分布在四川、云南、重庆等地[3]。

果实中的糖酸含量、糖酸组分和糖酸比是决定其果实风味的最重要指标[4-6],樱桃主要含有葡萄糖和果糖,苹果、梨等含有葡萄糖、果糖和蔗糖3种糖[7-9]。柑橘果实在发育过程中,通常以葡萄糖、蔗糖、果糖等可溶性糖,肌醇等糖醇类物质以及淀粉的形式积累碳水化合物。不同树种果实的主要有机酸种类和含量也存在较大差异,桃[10]、杏果实的主要有机酸是柠檬酸和苹果酸;葡萄[11]主要是苹果酸和酒石酸;越橘[12-13]主要是柠檬酸。Albertini等[14]发现所有柑橘品种在果实发育的前50 d 主要以奎宁酸为主,而到发育后期在酸性品种中以柠檬酸为主,在无酸品种中以苹果酸为主。而罗安才[15]发现柠檬酸是柑橘果实中最主要的有机酸,不同种类和品种的柑橘果实中,柠檬酸占整个果实有机酸含量的63.7%～96.7%,其次是苹果酸。由此可见,不同柑橘品种的有机酸含量存在巨大差异。柠檬果实中含有丰富的有机酸类、氨基酸类和糖类,目前关于苹果、梨、桃等果实的糖酸组分的研究已有较多报道[16-18],而关于柠檬的糖酸组分研究报道较少。果实品质是决定其果实市场竞争力的关键,目前我国柠檬主栽品种为尤力克,已显现品种老化、品质差、单产低等问题,因此,选育、引进优良柠檬品种对促进我国柠檬生产具有重要意义。

研究柠檬果实的糖酸组分有利于深入掌握品种特性,更好地为柠檬生产提供技术支持。品质评价是良种选育和果品选优的重要依据,还能按其标准将果品进行等级划分[19]。商品品质中果实形状、大小和色泽等都是对柠檬分级标准和满足消费者需求的重要指标。本试验以四川省安岳县同一柠檬高产优质示范资源圃内均为8年生的8个柠檬品种为研究对象,并以8年生的尤力克柠檬作为对照组,采用BSTFA衍生结合GC-MS技术对其糖酸组分进行分离鉴定,明确不同柠檬品种中糖酸的特征成分及差异,并对8个柠檬品种的果实品质进行比较研究,以期为实现柠檬提质增效、资源调查、品种更新以及产品深度开发提供理论依据,为筛选适宜四川地区的柠檬品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柠檬(每个品种选取5株长势、树形基本一致的成年结果树,于2016年10月从每株树冠东、南、西、北、中5个方向采摘5个处于同一成熟度的成熟期果实,按各品种进行混合,带回实验室,于-20 ℃冷藏) 采自四川省安岳县柠檬高产优质示范资源圃,均为8年生的尤力克、阿伦、费米耐劳、斐诺、库托迪肯、蒙纳盖洛、维尔纳和维拉弗兰卡8个柠檬品种,并将主栽品种尤力克柠檬设为对照组;甲醇(色谱纯) 美国Fisher公司;BSTFA(含1% TMCS)、甲氧胺盐酸盐吡啶、核糖醇 美国Sigma-Aldrich公司;氦气(99.999%) 四川恒发气体有限公司。

Agilent 7890A/5975C GC-MSD气相-质谱联用仪配备HP-5MS(30 m×250 μm,0.25 μm)色谱柱 美国Agilent公司;BT124S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;DN-12A氮气吹干仪 天津东康科技有限公司;ST 16R高速冷冻离心机 美国Thermo Fisher Scientific公司;LGJ-12冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司;SB-600DTD超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;UPH-Ⅱ-20T超纯水机 四川沃特尔水处理设备有限公司。

1.2 柠檬果实外在品质指标的测定

参照柠檬等级指标[20],观察带回实验室的8个柠檬品种果实,记载柠檬果实的果形、果面以及色泽。随机选取30个果实,用电子天平(精度0.01 g)测定果实单果重;用万分之一数显游标卡尺测量果实纵径、横径；计算果形指数即纵径/横径。具体分级指标及标准见表1。

表1 柠檬果实等级指标Table 1 Grading indices of lemon fruit

1.3 柠檬果实内在品质指标的测定

1.3.1 果实TSS、总酸含量和出汁率的测定 用数显测量仪测定可溶性固形物含量;将柠檬果实洗净去皮榨汁,参照酸碱中和滴定法测定其总酸含量[21]。固酸比即为可溶性固形物含量与总酸含量的比值。将柠檬果汁榨出,称果汁质量,计算出汁率。品质指标具体分级情况见表2。

表2 柠檬果实内在品质指标Table 2 Inner indices of lemon fruit

1.3.2 柠檬果实糖酸代谢组分测定

1.3.2.1 供试样品溶液制备 参照Ruiz-Matute等[22]和Schummer等[23]的方法稍作改进。待测样品经提取(浓缩净化、氮气吹干)-肟化-衍生化三个步骤制得,具体操作如下:将柠檬洗净、去籽、切片,经50 ℃烘干、粉碎后过 200 目网筛,准确称取0.1 g柠檬果实样品粉末置于EP离心管中,加入70%甲醇溶液4 mL,于常温、功率480 W条件下60 ℃超声提取30 min后,3000 r/min离心10 min,吸取上清液1 mL于康氏试管中,将氮气吹干后冷冻干燥,取出干燥后的康氏试管,加入20 mg·mL-1的甲氧胺盐酸盐吡啶溶液100 μL,用封口膜将管口密封,37 ℃保持90 min,撤膜再加入BSTFA(含有1% TMCS,易水解,操作时应注意环境相对湿度≤30%)100 μL,再次密封,70 ℃保持60 min,取出8000 r/min离心10 min,吸上清液,待机检测,样品应即制即测。

1.3.2.2 GC-MS条件及其方法学考察 GC条件:HP-5 MS毛细管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm);进样体积1 μL;分流比100∶1;载气为He(99.999%);升温程序见表3。

表3 柠檬果实中糖酸组分升温程序Table 3 Temperature program of carbohydrate and acid components in lemon fruit

MS条件:EI源(电子离子源)温度230 ℃;电子能量70 eV;MS四极杆温度150 ℃;接口温度280 ℃;扫描范围15～800 m/z、溶剂延迟5 min。

为了验证仪器的稳定性和检测柠檬糖酸代谢组分方法的可靠性,对该方法进行考察。精密度试验:精确吸取尤力克柠檬供试溶液,重复进样6次,计算主要色谱峰面积及其RSD。稳定性试验:精确吸取尤力克供试样品溶液1 μL分别于0、2、4、6、8、12和24 h后分别进样测定,计算主要色谱峰面积及其RSD。

1.4 数据处理

采用Excel 2016(Microsoft,Redmond,USA)进行数据统计,SPSS 23.0(IBM Watson,Armonk,USA)进行方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)。通过SPSS 23.0软件对8个柠檬品种果实糖酸代谢组分的相对含量进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 8个柠檬品种果实外观品质比较

由表4可知,其他7个品种与对照尤力克柠檬比较,果实的色泽没有发生明显变化，都呈现淡黄色,只有阿伦的色泽稍深,为黄色;8个品种果实光洁度未发生明显变化。斐诺的平均单果重显著大于维拉弗兰卡、阿伦、费米耐劳、维尔纳和蒙纳盖洛,高达216.88 g。斐诺和库托迪肯的最大单果重明显大于尤力克,分别达到277.95和256.45 g,维尔纳、费米耐劳、维拉弗兰卡、阿伦和蒙纳盖洛的最大单果重明显小于尤力克,分别为211.40、210.31、209.86、190.79和182.65 g。维尔纳的果形指数显著大于尤力克和其他6个柠檬品种,高达1.60;斐诺的果形指数显著大于蒙纳盖洛和费米耐劳,为1.42,维拉弗兰卡、库托迪肯和蒙纳盖洛的果形指数大于尤力克,但差异不显著,分别为1.36、1.35和1.33,费米耐劳和蒙纳盖洛的果形指数小于尤力克,但差异不显著,为1.28和1.31。8个柠檬品种的平均单果重和果形指数分别大于125 g和1.0,均达到优等果标准。

表4 8个柠檬品种果实外观品质比较Table 4 Comparison of fruit appearance quality of eight lemon cultivars

2.2 8个柠檬品种果实内在品质比较

2.2.1 8个柠檬品种果实TSS、总酸、固酸比及出汁率的比较 由表5可知,其他7个柠檬品种与对照尤力克比较,斐诺和尤力克的TSS含量显著高于其他6个品种,分别高达7.80%和7.71%,8个柠檬品种果实可溶性固形物的排列顺序为:斐诺>尤力克>维尔纳>维拉弗兰卡>库托迪肯>费米耐劳>蒙纳盖洛>阿伦。斐诺的总酸含量极显著高于尤力克和其他6个品种,达6.89%,8个柠檬品种果实总酸含量的排列顺序为:斐诺>尤力克>维拉弗兰卡>维尔纳>阿伦>库托迪肯>费米耐劳>蒙纳盖洛。

表5 8个柠檬品种果实内在品质的比较Table 5 Comparison of interior quality of eight lemon cultivars

蒙纳盖洛的固酸比显著高于维拉弗兰卡,高达1.19,显著高于费米耐劳和阿伦,且阿伦的固酸比显著低于尤力克和其他6个柠檬品种,蒙纳盖洛的固酸比显著高于维尔纳,维尔纳、斐诺、库托迪肯和维拉弗兰卡的固酸比低于尤力克,但差异不显著,分别为1.14、1.13、1.13和1.12,而费米耐劳的固酸比显著低于尤力克,为1.10。8个柠檬品种的出汁率各自呈现显著水平。综合8个柠檬品种的TSS、总酸和出汁率分析结果,尤力克、斐诺、维尔纳和维拉弗兰卡达到了优等果标准,阿伦、费米耐劳、库托迪肯和蒙纳盖洛达到一等果的标准。

2.2.2 8个柠檬品种果实糖酸组分测定结果

2.2.2.1 8个柠檬品种果实糖酸组分测定方法学考察结果 精密度试验结果显示柠檬果实中糖酸代谢组分的主要色谱峰面积的RSD介于1.12%～2.85%之间,表明该方法精密度良好;稳定性试验结果显示柠檬果实糖酸代谢组分的主要色谱峰面积的RSD介于0.98%～2.74%之间,表明该方法稳定性好。

2.2.2.2 8个柠檬品种果实糖酸组分定性分析 本试验成功建立了测定柠檬果实中糖酸组分的检测方法,结果见表6、表7。8个柠檬品种共鉴定出糖酸组分34种,包括木糖醇、L-山梨糖、D-阿拉伯糖等23种糖及衍生物，氨基己酸、苯丙酸、丁二酸等11种有机酸及氨基酸。从阿伦中鉴定出13种糖酸组分,占总峰面积的82.90%;尤力克中鉴定出14种糖酸组分,占总峰面积的84.78%;费米耐劳中鉴定出14种糖酸组分,占总峰面积的81.10%;斐诺中鉴定出13种糖酸组分,占总峰面积的93.62%;库托迪肯中鉴定出10种糖组分,占总峰面积的91.40%,未鉴定出酸组分;蒙纳盖洛中鉴定出10种糖酸组分,占总峰面积的88.46%;维尔纳中鉴定出9种糖酸组分,占总峰面积的79.02%;维拉弗兰卡中鉴定出12种糖酸组分,占总峰面积的88.41%,彼此间差异为0.05%～14.60%,8个柠檬品种果实代谢组分中化合物种类及相对含量间存在差异。

表6 8个柠檬品种果实糖组分及相对含量Table 6 Relative content of carbohydrate components in the fruits of eight lemon cultivars

表7 8个柠檬品种果实中酸组分及相对含量 Table 7 Relative content of acid components in the fruits of eight lemon cultivars

2.2.2.3 8个柠檬品种果实糖酸组分的相关性分析 以主栽品种尤力克作为标准进行相关性分析,结果见表8。由糖酸组分相似度计算结果可知,费米耐劳、斐诺、库托迪肯、蒙纳盖洛、维尔纳和维拉弗兰卡彼此之间呈现极显著正相关,相关系数介于0.8185和0.9872之间,尤力克与维拉弗兰卡呈负相关,与其他6个品种都呈正相关,但差异不显著,阿伦与其他6个品种都呈正相关,但差异不显著。

表8 8个柠檬品种果实糖酸组分的相关性分析Table 8 Similarity evaluation results of carbohydrate acid components in the fruits of eight lemon cultivars

3 讨论与结论

本研究成功建立了柠檬果实中糖酸代谢组分的GC-MS检测方法,检测结果显示从8个柠檬品种中共鉴定出代谢组分34种,其中糖及衍生物类23种、有机酸和氨基酸类11种,本研究结果与其他植物[24-25]的研究都能很好地解释GC-MS检出对象均为糖、有机酸和氨基酸及其衍生物等初生代谢产物,而次生代谢产物难以同初生代谢产物一起检出,这也是GC-MS分析代谢组分的局限性。分析结果发现,所检测出的34种糖酸组分,糖及衍生物所占比例远大于有机酸和氨基酸及其衍生物,这可能是由于BSTFA衍生试剂能更好的取代糖类化合物的活性氢,使硅烷化衍生物更易挥发,因此更易被检测到。

8个柠檬品种的品质比较结果表明,阿伦、费米耐劳、斐诺、库托迪肯、蒙纳盖洛、维尔纳和维拉弗兰卡7个柠檬品种果实的外观品质和内在品质与主栽品种尤力克之间存在差异,这与鲁剑巍等[26]、蔡跃台[27]的研究结果相类似。8个柠檬品种的平均单果重大于125 g,果形指数大于1.0,均达到优等果的标准。斐诺和尤力克的TSS含量分别高达7.80%和7.71%,极显著高于其他6个品种。斐诺的总酸含量极显著高于尤力克和其他6个品种,达6.89%。