龚 频,王思远,陈雪峰,张涛涛,陈福欣

(1.陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021; 2.西安科技大学化学与化工学院,陕西西安 710054)

随着食品工业的发展,食品安全问题愈发重要,逐渐成为一个全球重要的公共卫生问题,主要表现为非法添加事件频发、食源性致病菌引起的食品污染以及农药残留等问题。近期在包括比利时、荷兰、德国在内的至少7个欧盟国家发现含有杀虫剂氟虫腈成分的污染鸡蛋[1];常见的经济作物污染物霉菌毒素可以引起广泛的毒性,包括致癌性、神经毒性以及生殖和发育毒性[2],在全球范围内,超过30%的食品和饲料样品受到共同污染,与此污染相关的经济损失可能在每年数百万至数十亿美元之间[3],尽管在竭力控制,但产毒真菌无处不在且在易感农作物中频繁出现,并引发了一系列全球食品安全问题[4];此外还有国内的“三鹿奶粉事件”等。因此,快速对食品安全问题做出反应是关键,作为食品安全保障的重要技术支撑,食品安全快速检测技术的发展备受关注。

胶体金免疫层析试纸条技术(colloidal gold immunochromatography strip CGIS)是一种新型的胶体金标记免疫层析技术,可用于间接定性或半定量的检测[5]。胶体金免疫层析试纸条技术是结合胶体金检测的可视化和免疫层析检测的特异性强、快速便捷等特点于一体的一项新型免疫检测技术,已成为食品安全快速定量检测领域研究的热点。该技术操作简便、快速,检测特异性强、灵敏度高,无需特殊仪器设备,对检测人员要求较低,适合于临床医学、实验室、现场快速诊断及家庭的自我检测,已被广泛地应用于对微生物、农药残留、激素、重金属等类别的食品、药品、化工、生物、临床医学诸多领域的检测[6],因此,该技术具有良好的发展前景。本论文对胶体金免疫层析技术原理以及其在食品各领域的应用进行了简要的综述,并对其未来发展趋势进行了展望。

1 胶体金免疫层析试纸条的原理

1.1 胶体金及其标记原理

胶体金是继荧光标记、放射性核素标记及酶联免疫吸附法之后发展起来的固相标记物[7]。1971年Faulk等[8]将胶体金作为标记物用于免疫细胞学研究。解泉源等[9]利用荧光免疫微球标记的试纸条检测大肠杆菌O157∶H7。胶体金颗粒在电子显微镜下大多为较小的球形和大于30 nm的椭球形。胶体金也叫纳米金,为分散粒子直径在1～150 nm之间的疏水性金溶胶,属于多相不均匀体系,颜色呈红色到紫红色,这种独特的颜色使得在检测过程中可以用肉眼快速去检测样品,而不需要颜色标记[10]。另外,胶体金的纳米尺寸使其具备独特的免疫胶体金标记特性,而胶体金免疫技术检测的准确率和应用范围也因纳米粒径大小及颗粒分散性等因素的不同而不同[11]。

胶体金标记是由于胶体金在弱碱环境下带负电荷[12],与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固稳定的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性[13]。总之,蛋白质与金颗粒的结合是基于三个独立且相互依赖的非共价过程:带负电荷的纳米颗粒与蛋白质上带正电荷的位点之间的离子相互作用,蛋白质与金属表面之间的疏水吸引力以及金属与蛋白质上氮和硫原子导电电子之间的配位键合[14]。之所以此技术可以形成稳定的胶体,是由于胶体金表面的负电荷金颗粒通过在水中的静电排斥力而达到稳定状态[15],胶体金除了与蛋白质结合以外,还可以与许多其它生物大分子非共价结合,可以作为探针进行细胞表面及细胞内部大分子如多糖、蛋白质、多肽、核酸等的准确定位及定量检测。因此,近10多年来,胶体金标记已经成为一项重要的免疫标记技术,被广泛地应用于基础研究及检疫检验中。

1.2 胶体金及免疫胶体金的制备

1.2.1 胶体金的制备 由于生物纳米颗粒在免疫测定中性能取决于金颗粒的化学性质以及蛋白质的生物活性,所以制备出质量好的胶体金显得尤为重要,这关乎到试纸条的特性以及敏感性。胶体金的制备方法可以分为化学法和物理法,化学法是通过还原法制备胶体金,物理法则会用到热分解方法、超声化学、光化学、辐射分解等。但是最为常用的还是采用化学还原法,常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸及硼氢化钠等,其基本原理是使金离子还原变成金原子,使用不同种类、不同剂量的还原剂,可制备出不同大小的胶体金颗粒,其中柠檬酸钠还原法较为常用。刘亚东等[16]采用柠檬酸盐还原法制备粒径为25 nm的胶体金溶液;阮小蕾等[17]采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为25 nm的胶体金溶液;Wang等[18]采用1973年Frens所得出的方法进行制备,用柠檬酸钠直接去还原氯金酸得到粒径为17.46 nm的胶体金。胶体金的粒径及胶体金溶液的颜色与制备时加入柠檬酸三钠的量是密切相关的,因此,可以通过肉眼观察胶体金溶液的颜色或者通过测定吸光度来确定胶体金颗粒的大小,其观察依据见表1[19]。通常情况下通过外观就可以判断出胶体金的质量,如果胶体金溶液为澄清透明,无悬浮物,无沉淀,说明胶体金质量较好。

表1 四种粒径胶体金制备检测依据Table 1 Four particle size colloidal gold preparation test basis

1.2.2 免疫胶体金的制备 免疫胶体金的制备实际上是蛋白质等胶体被吸附到胶体金表面的过程,该过程受到很多方面的影响,如:电解质、蛋白质的量及pH等。薛海燕等[20]确定了最佳标记pH为8.0,最佳标记蛋白浓度为10 μL。Astrid Foubert等[21]在单克隆抗体与金纳米颗粒结合之前,构建絮凝曲线以得到最好的结合条件,用K2CO3去调节胶体金溶液pH,然后加入用Tris缓冲液(pH8.5,10 mmol/L)稀释的抗体反应15 min,加入牛血清白蛋白BSA溶液(胶体金/BSA=40/1(v/v)),剧烈搅拌混合物10 min,将离心得到的沉淀重悬于含有1% BSA和1%蔗糖的10 mmol/L Tris缓冲液中,得到单克隆抗体与胶体金的结合物。

总之免疫胶体金的标记过程常见的步骤如下[22]:

标记前需将蛋白质用双蒸水透析以除去影响标记的电解质;通过系列稀释法(包括1管无蛋白质的胶体金作为空白对照)找出能使胶体金稳定的蛋白质溶液的最低浓度,在此基础上再加1%～20%,即为最佳标记量;用0.1 mol/L的K2CO3或者0.1 mol/L的HCl调节胶体金的pH,使其尽量接近或者略高于包被蛋白质的等电点;将待标记蛋白以最佳标记量适当稀释后,缓慢滴加到胶体金中,继续搅拌20 min,然后缓慢滴加10%的BSA至终浓度为0.5%或1%(或加入10% PEG 20000至终浓度为1%),继续搅拌1 h。4 ℃静置2～3 h(或过夜),终止反应;反应结束后,4 ℃ 10000 r/min离心1 h,小心吸取清液,切忌倾倒;将沉淀悬浮于1/10原体积的1% BSA中,离心洗涤,加入等体积的1% BSA溶液,最后加入含0.02%叠氮钠防腐剂的TBS缓冲液悬浮,即可获得胶体金探针,也可加甘油混匀,4 ℃保存备用。

1.3 胶体金免疫层析试纸条的原理及制备

胶体金免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、层析膜、吸水滤纸、PVC板五部分构成。其构成如图1。

图1 胶体金免疫层析试纸条结构图Fig.1 Colloidal gold immunochromatographic test strip structure diagram

胶体金试纸条的制备与膜和垫的处理、胶体金的制备有很大关系。杨波等[23]确定最佳包被抗原及抗体工作浓度,再将其包被于NC膜上的T线和C线上,再将免疫胶体金包被于结合垫,按上述图制成长为9 cm、宽3 mm的试纸条。Yu等[24]通过采用直径为40 nm的胶体金和两种猪繁殖与呼吸综合症病毒蛋白质外壳混合物的缀合来制备免疫胶体金,将0.8 mg/mL的蛋白质混合物和2 mg/mL抗体包被于NC膜上作为T线和C线,由此组成的试纸条可以在4～30 ℃下保持1年。

胶体金免疫层析试纸条技术由于其试纸条的结构以及其检测原理,可广泛应用于大分子类蛋白质以及小分子类毒素等的检测;试纸条的操作简单,无需经过专业训练,结果直观;试纸条尺寸小携带方便,可实现现场检测;标记物胶体金毒性较其他标记物低,安全性高。

2 胶体金免疫层析试纸条技术在食品各领域的应用

食品安全问题已经成为全球性问题,食品中的致病菌及其毒素、食品中加入非法化学成分以及外界环境对食品的污染等都是引起食品安全问题的主要原因。因此,必须建立一种特异、灵敏、快速的检测方法以确保食品安全。目前,国内在食品安全检测方面还集中于传统的微生物培养、ELISA及PCR等技术,由于其检测时间长、成本较高等缺点，不适宜检测技术的现场实施。而胶体金免疫层析技术不需要特殊的检测仪器,操作时间短,而且方便携带,适用于现场检测,检测时间从样品处理到结果处理大约在30 min之内,基本无假阳性的出现,并且基本满足食品安全食用标准的检测要求,在食品检验检疫方面具有较好的应用价值。表2列出该技术在各领域的部分检测情况。

表2 免疫层析试纸条技术在食品各领域的应用Table 2 Application of immunochromatographic test strip technology in various fields of food

2.1 胶体金免疫试纸条技术在食品污染物检测方面的应用

卢守英[28]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,以金标AFB1单克隆抗体作为探针,将AFB1-BSA(检测线)和羊抗鼠IgG(质控线)分别包被在硝酸纤维素膜上,构建了间接竞争胶体金免疫层析检测体系,研制出AFB1胶体金免疫层析试纸条,其检出限为5 ng/mL,检测时间为5～10 min,适用于对AFB1进行现场检测。

玉米赤霉烯酮是一类由镰刀菌产生的次生代谢物,广泛存在于玉米、大麦、燕麦、小麦、大米和高粱等作物中。它不仅影响农作物的经济和营养价值,还对人畜有一定的毒害作用。赵红艳[29]制备了赤霉烯酮的胶体金免疫层析试纸条,其最低检测限为30 μg/kg。伏马菌素是由轮枝镰孢菌与串珠镰孢菌所产生的一类水溶性代谢产物,具有生殖毒性和免疫毒性,能污染玉米、小麦、水稻等谷类及其制品。樊海新等[30]建立了快速检测伏马菌素B1的胶体金免疫层析试纸条,灵敏度可达到2 ng/mL,检测时间仅需10 min。Fabio Di Nardo等[31]建立了基于金纳米粒子的多色免疫层析试纸去测定黄曲霉毒素B1和伏马菌素,可以同时快速测定玉米粉中的两种霉菌毒素,黄曲霉毒素B1的视觉检出限为2 μg/kg,伏马菌素的视觉检出限为1000 μg/kg,这是第一个基于使用不同颜色金纳米粒子的多色免疫层析试纸,即通过使用蓝色沙漠玫瑰状金纳米粒子(DR-GNPs)和红色球状金纳米粒子(s-GNP)来作为标记物。Yao等[32]成功制备了以胶体金为标记的抗伏马菌素B1单克隆抗体探针,用于建立免疫层析条带,试纸条显示出高灵敏度和特异性,检出限为11.24 ng/mL。由于样品制备过程简单且与其他方法有高度一致性,该方法已广泛运用于全球范围。

2.2 胶体金免疫试纸条技术在食品非法添加剂检测方面的应用

食品安全的另一大问题就是非法添加剂的使用,对牛奶、奶粉、饲料中所添加的三聚氰胺[33-34]、牛奶中新霉素[35]等的快速检测就显得至关重要。

目前,氯霉素、孔雀石绿和硝基呋喃类药物在水产品中残留最为严重,属于必检项目[36]。这些药物简单且廉价易得,因而在水产品养殖中使用较广,在动物体内代谢时间较长,能够不同程度地在水产品中蓄积,最后通过食物链的作用危害人体健康,主要表现为致癌、致畸、致突变等现象。硝基呋喃类药物是一种广谱性抗菌药物,在低浓度下对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、某些真菌和原虫有抑制作用,高浓度则有杀灭作用,其抑菌作用机理是干扰细菌体内的氧化还原酶系统,致使细菌代谢紊乱,常用于治疗和预防鱼类及畜禽类因感染沙门氏菌和大肠埃希菌而引起的疾病,在畜牧业及水产养殖中使用广泛。柳爱春等[37]建立了水产品中硝基呋喃代谢物GICA快速检测方法,成功研制出了免疫胶体金快速检测试剂盒,对3-氨基-2-唑烷基酮的最低检出限是0.5 μg/kg,对氨基脲、1-氨基-2-内酰脲的检出限为1.0 μg/kg,并与LC-MS/MS法的检测结果对比,符合率为98%。潘嘉慧等[38]制备了呋喃妥因代谢物胶体金免疫层析试纸条,其检测限为1.0 μg/kg。

氯霉素是一种广谱抗菌素,被广泛用于治疗伤寒等疾病。研究表明,如果人们长期食用含有氯霉素残留的动物源性食品,将对健康构成直接或潜在的威胁。许多国家对食品中氯霉素残留的最大允许检出限量低至0.3 ng/g。许胜男[39]建立了磁固相萃取前处理与胶体金免疫层析试纸条联用的方法,一方面了扩大了试纸条的使用范围,另外一方面实现了在蜂蜜和鸡蛋样品中的检出限低至0.2 ng/g的水平。龚云飞等[40]制备的三聚氰胺胶体金检测试纸条对牛奶、奶粉和饲料中的三聚氰胺残留的检出限分别为100 g/L、100 ng/g和200 ng/g,在常温干燥环境下可至少保质6个月,能够检测出三聚氰胺含量大于50 g/L的样品,适用于现场实际样品的三聚氰胺残留水平监测,具有良好的应用前景。Liu等[41]开发了基于抗体的胶体金免疫层析侧向流动试纸条,用于检测牛乳和酸奶样品中的游霉素(Nata)残留物,将产生针对其残留物的单克隆抗体(mAb)与金纳米颗粒缀合形成免疫胶体金来达到标记作用,并且这种半定量方法仅需15 min即可完成检测,包被抗原和mAb的最佳浓度分别为0.15、0.2 μg/mL,而基于光密度扫描仪,牛奶和酸奶样品中Nata的视觉检出限分别为5 μg/L和10 μg/kg。

2.3 胶体金免疫试纸条技术在食源性致病菌检测方面的应用

食源性致病菌也是食品安全的重大隐患之一,常见的有大肠杆菌、沙门氏菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等,对致病菌快速高灵敏的检测能够有效阻断其传播途径,因此对于食品中副溶血性弧菌[42-43]、氯霉素[44]等的检测是关键。

潘秀华等[45]采用DNAStar软件对单增李斯特菌inlA全长基因编码蛋白进行抗原表位分析,截取部分inlA基因片段构建原核表达质粒,诱导表达和纯化获得重组蛋白。以该蛋白免疫BALB/c小鼠,筛选高效分泌抗InlA单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体;以双抗体夹心的原理研制胶体金免疫层析检测试纸条,该试纸条对单增李斯特菌纯培养物敏感性为2.4×105CFU/mL,模拟猪肉样品敏感性为4.0×106CFU/mL,在4 ℃下的保存期可达16周以上。布日额等[46]将鼠抗S.aureusIgG进行胶体金标记,并喷涂于玻璃纤维上制备金标垫,分别以兔抗S.aureusnEBPS重组蛋白IgG和羊抗鼠IgG作为检测线和质控线,组装制备快速检测牛乳中致病性S.aureus胶体金免疫层析试纸条,金黄色葡萄球菌试纸条能够最低检出1.0×105CFU/mL的S.aureus。海产品也是较易被污染的对象,Wu等[47]开发用于快速检测罗非鱼无乳链球菌的胶体金免疫层析试纸条,其灵敏度是1.5×105菌落形成单位(CFU),与其他常见的细菌没有交叉反应且与ELISA法检测结果一致,检测时间小于15 min,试纸条的有效性在4 ℃下保持6个月。Song等[48]利用胶体金免疫层析条带成功开发了一种同时检测志贺氏菌和大肠杆菌O157∶H7的模型条带,用于检测面包、果酱以及牛奶中的食源性致病菌,对于志贺氏菌和大肠杆菌O157∶H7条带测试的灵敏度确定为106CFU/mL,并且没有与其他相关细菌交叉反应。目前胶体金免疫层析技术可较好地解决常规致病菌检测流程所面临的操作复杂、特异性低以及灵敏度低等问题,但对多种致病菌同时检测是当下的趋势。

2.4 胶体金试纸条技术在食品中农药残留检测方面的应用

在农药兽药残留检测中,在对猪肉中磺胺类[49](磺胺二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺二甲基嘧啶)和克伦特罗药物残留[50-51]、猪肝中喹乙醇[52]、牛奶中氨基糖苷类药物残留[53]的快速检测,还包括在对水产品中孔雀石绿[54]、贝毒素[55]和水中残留抑菌剂磺胺类药物[56]、硝基呋喃类代谢物[57]及恩诺沙星[58]的快速检测中,胶体金试纸条都发挥着重要作用。

氯噻啉是一种作用于烟酸乙酰胆碱酯酶受体的新烟碱类内吸性杀虫剂,因其活性高、毒性低、杀虫谱广,被广泛应用于水稻、小麦、蔬菜、果树等作物中,用于防治蚜虫、叶蝉、飞虱等刺吸式口器害虫,对鞘翅目、双翅目和鳞翅目害虫也有效[5]。随着氯噻啉使用量的提高,其残留问题也日益受到关注。施海燕等[59]利用生物素-链霉亲和素的高亲和作用,将氯噻啉抗体和生物素化DNA与13 nm胶体金双标记,将链霉亲和素与41 nm胶体金标记,制备了氯噻啉胶体金增强免疫层析试纸条,试纸条可在10 min内实现可视化判读,检出限为25 ng/mL,氯噻啉在河水、大米、黄瓜、番茄、梨、甘蓝和苹果样品中的添加浓度为0.05、0.5和5 μg/g时,GICA的检测结果均符合添加水平。Joel Isanga等[60]开发了阿米卡星敏感的单克隆抗体(MAb)测定和免疫色谱试纸条,并将其用于检测牛乳和鸡蛋中抗生素阿米卡星残留,该免疫测定所使用的MAb对阿米卡星具有特异性且对其他氨基糖苷类抗生素没有交叉反应,测试过程可在10 min内完成且视觉检出限为5.0 ng/mL。Laxmana Naik等[61]开发了一种快速,半定量侧流测定(LFA)来筛选牛奶样品中的土霉素(OTC)抗生素残留物,通过将OTC掺加到无抗生素的牛奶样品中验证测定,结果可在5 min内完成,视觉检测限为30 μg/mL。

2.5 胶体金试纸条技术在食品中重金属污染检测方面的应用

近年来,我国发生多起重金属污染事件,目前国内重金属的检测方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)、原子荧光法、紫外可见分光光度法、高效液相色谱法等,但这些方法检测时间长,所需样品前处理较为繁琐,对仪器及实验人员的要求较高。

朱旭东等[62]利用IEDTA螯合镉离子,并与匙孔血蓝蛋白KLH偶联,合成镉离子抗原。经过免疫小鼠及细胞融合后筛选到镉离子的单克隆抗体细胞株。通过亲和层析的方法制备得到镉单克隆抗体,并建立了粮食样本中竞争法原理的重金属镉胶体金免疫层析定量检测方法,该方法检测灵敏度为50 μg/kg,定量检测范围为50～400 μg/kg,为粮食中重金属镉检测提供了一个有效的途径。

王亚楠等[63]用异硫氰酯法合成Cr3+-i EDTA-BSA,细胞融合技术筛选Cr3+-EDTA mAb细胞株,体内诱生腹水法制备Cr3+-EDTA mAb,建立了更加灵敏、特异的铬离子胶体金免疫层析快速检测方法。检测特异性较好,检出限为5 μg/L,检测时间为10 min。

3 现有不足

免疫胶体金快速诊断技术的简便、快速、相对灵敏以及较低基质效应[64]等优点,使其更适合于社会防疫、家庭生活、生物武器以及现场检测等方面,也为胶体金标记免疫技术同时检测多种物质提供了新的思路。然而,该技术目前的检出限高于较其他标记物,所以作为标记物还存在一些缺陷。

研究表明标记材料的不同对侧向流动测定灵敏度有很大的影响[65],与其他标记物相比,用胶体金所标记的试纸条,其视觉检出限要高于其他标记物,Hu等[65]首次系统地比较了时间分辨荧光纳米珠(TRFN-LFA),荧光亚微球(FM-LFA)、量子点(QD-LFA)和基于胶体金(CG-LFA)的侧向流动测定,以基于竞争的方式定量检测猪尿液中的莱克多巴胺,其检出限分别为7.2、14.7、23.6和40.1 pg/mL;Tang等[66]利用胶体金和Eu3+掺杂的荧光微球用作标记以开发用于检测牛奶中三聚氰胺的免疫色谱条并对其进行比较,结果表明利用胶体金所得视觉检出限为150 μg/L,要高于Eu3+掺杂的荧光微球75 μg/L;Zhang[64]成功建立了时间分辨荧光纳米珠(TRFN-ICA)和胶体金免疫层析法(CG-ICA),并对二者在间接竞争方式的基础上对猪尿中克伦特罗定量检测进行了系统比较,TRFN-ICA的灵敏度优于CG-ICA且前者的检测时间少于后者。Li等[67]利用胶体金、量子点和聚苯乙烯微球作为三种侧流免疫色谱测定(ICAs)中的标记,用于检测谷物样品中的玉米赤霉烯酮,结果显示胶体金标记的检出限为10 μg/L,量子点和聚苯乙烯微球基的检出限为1 μg/L,用胶体金标记的检出限远高于其他两种。由此可见基于胶体金标记的免疫层析技术还有其不足之处。

4 展望

目前胶体金免疫层析试纸条技术在食品质量与食品安全上都有广泛应用,但随着现代生物技术和纳米材料的发展,出现了多种新型的标记材料,包括量子点、荧光微球、上转磷光纳米粒子、纳米磁珠、镧系稀土、碳纳米颗粒[68]、脂质体[69]等作为标记材料将逐渐代替胶体金,成为免疫层析试纸条技术发展的新方向[70]。单一的标记材料可能会影响到该技术的灵敏度,所以结合其他标记材料以制成新型多功能材料来富集目标物,提高该技术的灵敏度和检测速度是研究趋势之一;其定性检测方式也会制约其发展,所以将该技术与相关读数仪结合来开发出快速定量检测试剂盒是必要的,这顺应了该技术的发展前景,使之成为更有效的食品检测工具。