孙福仁 高晗 李雪利 张肖建 李军山 李振江

摘要：为提高佛手配方颗粒的质量评价标准，利用佛手标准汤剂控制佛手配方颗粒的内在质量。以15批不同产地的佛手饮片为原料，制备佛手标准汤剂，建立含量测定方法，以柚皮苷、橙皮苷为指标成分，测定了15批佛手标准汤剂的相关含量。结果表明：柚皮苷、橙皮苷分别在0.0251～0.1255，0.1605～0.8023μg范围内线性关系良好（r=0.9999），平均加样回收率分别为102.27%和101.48%，重复性考察RSD值分别为0.78%和0.89%，12h稳定性考察RSD值分别为0.59%和1.46%。所提出的方法能同时测定柚皮苷和橙波苷两种成分，节约了分析时间，提高了佛手产品的质量标准。

关键词：中药化学;佛手标准汤剂;橙皮苷;柚皮苷;含量测定

中图分类号：R284.1文献标志码：A

doi：10.7535/hbgykj.2019yx03012

文章编号：1008-1534（2019）03-0221-06

佛手系芸香科植物佛手的干燥果实，具有梳理肝气、止痛、和胃的功效[1]，为常用理气中药。成熟佛手果实中含有柠檬油素、5-异戊烯氧基-7-甲氧基香豆素、6，7-二甲氧基香豆素、7-羟基-6-甲氧基香豆素、4-甲氧基联卞、柠檬内酯、Δ5，22-豆甾烯醇、棕榈酸等成分[2-3]。现代药理学研究表明：佛手具有降低脂质代谢、降低总胆固醇、促进糖脂代谢等生物活性[4-6];佛手醇提液具有显著镇咳、平喘、祛痰作用，可提高机体的抗应激能力[7]。

关于佛手中相关含量的测定研究，文献[8]和文献[9]介绍了采用RP-HPLC法测定佛手中的橙皮苷含量;金晓玲等[10]测定出佛手饮片中的粗蛋白质量分数为9.37%，氨基酸质量分数为8.334%;曹斯琼等[11]应用UPLC指纹图谱方法，对广佛手饮片、水煎液、配方颗粒进行了相似度评价研究。HPLC指纹图谱方法的建立，可用于评价佛手质量[12-13]。然而，迄今尚未见有佛手标准汤剂含量测定方法的报道。佛手标准汤剂是以传统煎煮法为理论依据，经提取制备而成的膏粉或浓缩液，用于衡量佛手配方颗粒的内在质量。笔者收集了不同产地的佛手饮片制备佛手标准汤剂，采用建立的能够同时测定柚皮苷、橙皮苷含量的测定方法，对15批佛手标准汤剂含量进行了测定。

1主要仪器与材料

CPA225D电子分析天平，德国赛多利斯股份公司提供;KH-7200E超声波清洗器，江苏昆山禾创超声波仪器有限公司提供;WATERSCLASSHUPLC液相色谱仪，AgilentZorbaxEcilpesC18色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm）。

15批不同产地、不同批次的佛手饮片，分别采购于四川、广东、缅甸、越南、泰国等地，且于不同时间采收加工，经原河北省药品检验所孙宝惠老师鉴定，确定为芸香科植物佛手的干燥果实经炮制加工后的饮片，饮片来源及批号见表1。

橙皮苷对照品，中国药品生物制品检定所提供，纯度为94.5%;柚皮苷对照品，中国药品生物制品检定所提供，纯度为96.5%;甲醇，色谱纯，天津科密欧有限公司提供;乙腈，色谱纯，天津科密欧有限公司提供;其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2方法与结果

2.1色谱条件和系统适用性

采用AgilentZorbaxEcilpesC18色谱柱（2.1mm×100mm，1.7μm），以乙腈-0.1%（体积分数，下同）磷酸为流动相，检测波长为283nm，柱温为30℃，流速为0.2mL/min，理论板数按橙皮苷、柚皮苷峰计算应不低于5000[14-15]，测定条件见表2，色谱图见图1。

2.2对照品溶液的制备

精密称定用干燥剂减压干燥24h的柚皮苷5.51mg、橙皮苷9.73mg，置于50mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。精密吸取2mL，放入10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀，即得每1mL含柚皮苷22.0μg、橙皮苷38.9μg的混合对照品溶液。

2.3佛手标准汤剂的制备

取各批次佛手饮片，除去杂质。称取100g，放入圆底烧瓶中，加入饮片量12倍的水，浸泡30min，加热煎煮30min。第2次加入饮片量10倍的水，加热煎煮20min。合并2次煎液，用0.074mm（200目）筛网过滤煎煮液，合并滤液。在高于60℃的温度下，将佛手提取液用旋转蒸发仪浓缩，浓缩至生药量与浓缩液体积比约为1∶3，再经浓缩液冷冻干燥机干燥，得到干膏粉，即佛手标准汤剂。

2.4供试品溶液的制备

取各批次佛手标准汤剂，粉碎过2号筛。精密称定0.3g，转移至具塞锥形瓶中，精密加入90%甲醇25mL，超声（功率为250W，频率为40kHz）处理10min，再称定质量。用90%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.5方法学考察

2.5.1標准曲线

分别精密吸取对照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0μL，按上述色谱条件进行测定，记录峰面积。分别以柚皮苷、橙皮苷的进样量（X）为横坐标，测定的峰面积（Y）为纵坐标，线性关系结果见表3。结果表明，2种成分在适当范围内线性关系良好。

2.5.2精密度

取佛手标准汤剂S13样品，参考供试品制备方法进行处理，依照上述色谱条件连续进样5次，计算峰面积的RSD值，测定结果见表4。结果表明，柚皮苷与橙皮苷峰面积基本不变，RSD值分别为1.37%和1.52%，说明仪器的精密度良好。

2.5.3稳定性

取佛手标准汤剂S13干膏粉适量，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依照上述色谱条件分别于0，2，4，8，12h进样测定，计算柚皮苷的峰面积，结果见表5。由表5可知，柚皮苷和橙皮苷RSD值分别为0.59%和1.46%（n=5），表明样品中柚皮苷、橙皮苷在溶液状态下12h内稳定。

2.5.4重复性

取佛手标准汤剂S13干膏粉适量，分别称取5份，按供试品溶液制备方法制备。精密吸取供试品溶液1μL，依照上述色谱条件进行测定，结果见表6。结果表明，供试品溶液中柚皮苷、橙皮苷含量的RSD值分别为0.80%和0.84%（n=5），说明方法的重复性良好。

2.5.5加样回收率

取同一批干膏粉（S13）9份，精密称定。分别精密加入一定量的柚皮苷、橙皮苷储备液，依照供试品溶液制备方法制备，按上述色谱条件测定，每份平行测定2次，结果见表7。由表7可知，柚皮苷的平均回收率为102.27%（n=9），橙皮苷的平均回收率为101.48%（n=9）。说明方法的回收率较好，符合要求。

2.6样品测定

取佛手标准汤剂适量，按照2.4项所述方法制备样品溶液。另取柚皮苷、橙皮苷对照品适量，按照2.2项所述方法制备对照品溶液。按上述色谱条件进样，记录柚皮苷、橙皮苷峰面积，计算含量，结果见表8。

由表8可知，标准汤剂中柚皮苷与橙皮苷的含量测定和转移率数据平行性良好。15批佛手标准汤剂中指标成分柚皮苷与橙皮苷含量之和为0.0299%～0.0849%，平均含量为0.0601%，SD值为0.0152%，RSD值为25.28%。柚皮苷与橙皮苷含量之和平均值的70%～130%的范围为0.0420%～0.0781%，平均值加减3倍SD值的范围为0.0145%～0.1056%。

3讨论

3.1检测波长的选择

柚皮苷、橙皮苷紫外光谱图如图2所示。由图2可从看出，柚皮苷、橙皮苷均为黄酮类成分，在紫外多个波段有吸收，283nm波长处有最大紫外吸收，故确定283nm为检测波长。

3.2提取溶剂的选择

柚皮苷、橙皮苷2种成分水溶性极差，适宜用有机溶剂提取。考虑到佛手标准汤剂使用水作为提取溶媒、使用100%甲醇作提取溶剂时，膏粉容易结块，不能完全分散开，经实验考察，分别使用甲醇、90%甲醇、70%甲醇、50%甲醇为提取溶剂进行含量比较，发现采用90%甲醇为提取溶剂时的含量最高，故选择90%甲醇作为提取溶剂。

3.3流动相选择

分别比较了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸3种流动相，结果发现，采用乙腈-0.1%磷酸为流动相的分离效果较好，故确定其作为流动相。此外，橙皮苷、柚皮苷化学结构类似，极性接近，使用梯度洗脱的方法分析时间较长，故采用梯度洗脱方式分离，可使佛手标准汤剂中的其他成分与目标成分之间实现较好地分离。

4结语

1）《中华人民共和国药典》2015版中仅介绍了佛手含量测定以橙皮苷单一成分为指标。通过方法摸索，在UPLC设备上建立了能夠同时测定柚皮苷、橙皮苷2种成分的方法，节约了分析时间，提高了质量标准。

2）受佛手产地地理位置的影响，15批佛手饮片中橙皮苷的含量相差较大。标准汤剂以水作为溶媒时橙皮苷的水溶性较差，而15批佛手标准汤剂中柚皮苷与橙皮苷含量之和转移率范围为28.01%～43.64%，因此，佛手标准汤剂应以柚皮苷、橙皮苷含量之和作为指标成分。

3）本次研究利用UPLC法，采取梯度洗脱，建立了能够同时测定柚皮苷和橙皮苷2种成分的分析方法，对文献报道中的5，7-二甲氧基香豆素的成分也进行了相关分析。然而，由于此成分在佛手标准汤剂中的含量较低，含量转移率低于5%，故在含量测定指标筛选时，舍去了该成分。黄酮类成分在佛手标准汤剂中所占的量较大，今后需对其作进一步的研究。

参考文献/References：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[2]张颖，孔令义.佛手化学成分的研究[J].中国现代中药，2008，8（6）：16-17.

ZHANGYing，KONGLingyi.StudiesontheconstituentsofCitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle[J].ModernChineseMedicine，2008，8（6）：16-17.

[3]高幼衡，黄海波，徐鸿华，等.佛手化学成分研究[J].中药材，2002，25（9）：639-640.

GAOYouheng，HUANGHaibo，XUHonghua，etal.StudiesonthechemicalconsitutentsofCitrusmedicaL.var.sarcodactylis[J].JournalofChineseMedicinalMaterials，2002，25（9）：639-640.

[4]史晶晶，时博.橙皮苷对高脂血症模型大鼠代谢紊乱的影响[J].中医学报，2016，31（4）：554-557.

SHIJingjing，SHIBo.Effectofhesperidinonlipidmetabolismdisorderinhyperlipemiamodelrats[J].ActaChineseMedicine，2016，31（4）：554-557.

[5]PARAFATIM，LUSCIAA，MORITTAVM，etal.Bergamedpolyphenolfractionpreventsnonalcoholicfartyliverdiseaseviastimulationoflipophagyincafeteriadietinducedratmodelofmetabolicsyndrome[J].JournalofNutritionalBiochemistry，2015，26（9）：938-948.

[6]吴昊，橘波，何俏军，等.新橙皮苷在制备预防糖尿病药物中的应用[P].中国专利：CN102772424A，2012-06-13.

[7]金曉玲，徐丽珊，何新霞.佛手醇提取液的药理作用研究[J].中国中药杂志，2002，27（8）：604-606.

[8]宋剑锋，富同义.RP-HPLC法测定佛手饮片中橙皮苷含量[J].中华中医药学刊，2007，25（5）：1036-1037.

SONGJianfeng，FUTongyi.ContentdeterminationofhesperidininfructusCitrissarcodactylisbyRP-HPLC[J].ChineseArchivesofTraditionalChineseMedicine，2007，25（5）：1036-1037.

[9]曾建伟，吴锦忠，林忠宁，等.HPLC测定不同产地佛手中橙皮苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（19）：97-99.

ZENGJianwei，WUJinzhong，LINZhongning，etal.DeterminationofhesperidininfructusCitrissarcodactylisfromdifferentprovenancesbyHPLC[J].ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormalae，2012，18（19）：97-99.

[10]金晓玲，曹诣斌，徐丽珊，等.佛手氨基酸及多糖含量的测定[J].浙江师范大学学报（自然科学版），2002，25（1）：66-68.

JINXiaoling，CAOYibin，XULishan，etal.ContentsofaminoacidsandpolysaccharidesfromBergamot[J].JournalofZhejiangNormalUniversity（NaturalSciences），2002，25（1）：66-68.

[11]曹斯琼，陈向东，黄丹丹，等.佛手配方颗粒UPLC指纹图谱研究[J].海峡药学，2018，30（6）：48-52.

CAOSiqiong，CHENXiangdong，HUANGDandan，etal.UPLCfingerprintanalysisofCitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingleformulagranules[J].StraitPharmaceuticalJournal，2018，30（6）：48-52.

[12]李金玉，贺文婷，王喜英.不同采收期广佛手指纹图谱研究[J].安徽农业科学，2015，43（14）：99-101.

LIJinyu，HEWenting，WANGXiying.HPLCfingerprintoffructusCitrisarcodactylisindifferentpickingtimes[J].JournalofAnhuiAgriculturalSciences，2015，43（14）：99-101.

[13]林乐维，蒋林，郝大庆，等.不同产地广佛手药材HPLC指纹图谱的研究[J].中成药，2009，31（12）：1805-1808.

LINLewei，JIANGLin，HAODaqing，etal.HPLCfingerprintoffructusCitrisarcodactylisfromGuangdongprovince[J].ChinsesTraditionalPatentMedicine，2009，31（12）：1805-1808.

[14]孙福仁，李军山，马浩，等.基于UPLC特征图谱与主成分分析评价白芷配方颗粒质量研究[J].河北工业科技，2018，35（6）：454-458.

SUNFuren，LIJunshan，MAHao，etal.StudyonevaluationofthequalityofformulagranuleofAngelicaedahuricaebasedonUPLCandPCA[J].HebeiJournalofIndustrialScienceandTechnology，2018，35（6）：454-458.

[15]田方，李军山，常云凤，等.一测多评法同时测定车前子配方颗粒中3种成分含量[J].河北工业科技，2018，35（6）：459-464.

TIANFang，LIJunshan，CHANGYunfeng，etal.SimultaneousdeterminationofthreeconstituentsinPlantagoseedformulagranulesbyQAMS[J].HebeiJournalofIndustrialScienceandTechnology，2018，35（6）：459-464.