向明 李媛媛 郭乾鹏 任亚雪 梁世忠 黄怡

摘要：【目的】分析屎肠球菌（Enterococcus faecium）活菌对哺乳期仔猪结肠微生物群落优势门属的持续影响，为揭示益生菌调节仔猪肠道健康的作用机制及人为调控仔猪肠道微生物以促进其健康提供参考依据。【方法】給健康新生仔猪灌服无菌脱脂乳（对照组）或屎肠球菌制剂（益生菌组），持续灌服6 d，分别采集7和21日龄仔猪结肠内容物，提取总细菌DNA后进行PCR扩增，采用Illumina MiSeq高通量测序技术检测16S rRNA序列的V3～V4可变区，分析肠道微生物群落α多样性及其在门和属分类水平上的结构特点。【结果】给新生仔猪灌服屎肠球菌并不影响7和21日龄仔猪结肠微生物群落α多样性。与对照组相比，益生菌组7日龄仔猪结肠微生物群落优势门的相对丰度无显著变化（P>0.05，下同），21日龄仔猪拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度也无显著差异，但变形杆菌门（Proteobacteria）相对丰度呈显著增加趋势（P<0.05，下同）;在属水平上，益生菌组7日龄仔猪结肠微生物群落中相对丰度变化明显的优势属均隶属于拟杆菌门，其中，普雷沃氏菌属（Prevotella）相对丰度显著增加，而拟杆菌属（Bacteroides）相对丰度极显著减少（P<0.01，下同），丁酸单胞菌属（Butyricimonas）相对丰度显著减少;21日龄仔猪结肠微生物群落中66.67%优势属的相对丰度呈减少趋势，其中以厚壁菌门4个属的变化尤其明显，即巨型球菌属（Megasphaera）相对丰度极显著减少，乳杆菌属（Lactobacillus）、产琥珀酸菌属（Succiniclasticum）和粪杆菌属（Faecalibacterium）相对丰度显著减少。【结论】新生仔猪口服屎肠球菌能对其结肠微生物群落优势门或属组成产生持续影响，表现为促进有益于结肠健康菌属的生长，而抑制具有潜在致病性菌属的增殖，为今后定向研究调控仔猪肠道健康的肠道共生微生物提供明确范围。

关键词： 仔猪;屎肠球菌;结肠;微生物群落;α多样性;高通量测序

中图分类号：  S878.45                      文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）03-0477-08

0 引言

【研究意义】健康哺乳动物大肠内一般栖居着400～500种微生物，每克内容物中的活菌数量达1013～1014个（Gill et al.，2006）。这些微生物互利共存，形成复杂的生态系统，即肠道微生物群落（肠道菌群）。肠道微生物群落对宿主起抵抗病原菌入侵、增强肠黏膜免疫力、促进养分消化吸收及调节肠上皮细胞生长等重要生理功能作用（Hooper and Gordon，2001），表明肠道微生物群落组成与宿主健康密切相关（Mach et al.，2015）。因此，研究益生菌对机体肠道微生物群落的调节作用对阐明其益生作用机制具有重要意义。【前人研究进展】针对肠道微生物群落的研究方法主要有传统的体外培养方法和不依赖于培养的分子生物学方法，后者包括变性梯度凝胶电泳（DGGE）、实时荧光定量PCR及高通量测序技术等（曾燕等，2018）。目前，研究益生菌对仔猪肠道菌群的影响主要采用体外培养方法，并证实饲喂乳杆菌、双歧杆菌或屎肠球菌等可增加仔猪肠道乳杆菌或双歧杆菌等有益菌数量（Estrada et al.，2001;Huang et al.，2004;Chiang et al.，2015），同时减少大肠杆菌或梭菌等致病菌数量（黄怡等，2012;Liu et al.，2014）。也有学者应用DGGE技术研究益生菌对仔猪肠道菌群的影响，如Pieper等（2009）借助DGGE技术研究发现，植物乳杆菌能增加哺乳期仔猪肠道某些有益菌的多样性和丰度。无论是体外培养方法还是DGGE技术，都存在一定的局限性，只能研究肠道微生物群落中极少数可培养的微生物物种，或少数丰度较高的微生物类群（夏围围和贾仲君，2014），因而无法准确评价益生菌对仔猪肠道整体微生物群落的影响。高通量测序技术可分析整体的微生物群落水平，包括丰度较低的微生物类群，因此能更全面和准确地反映肠道微生物群落的结构变化。Aktas等（2016）通过Ion Torrent PGM高通量测序研究发现，不同乳杆菌菌株对小鼠盲肠菌群的影响在门或属分类水平上存在明显差异，说乳杆菌调节宿主菌群的能力存在因菌株而异的特点。陈曦等（2016）利用高通量测序技术研究屎肠球菌对断奶仔猪粪便微生物群落的影响，结果发现屎肠球菌能有效增加断奶仔猪粪便菌群α多样性及厚壁菌门、变形菌门、无壁菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门和放线菌门细菌的丰度，受屎肠球菌影响后丰度高于1%的优势属主要有乳杆菌属、瘤胃球菌属、颤螺旋菌属和罗斯氏菌属等。【本研究切入点】肠道微生物群落组成因动物的种类、生理阶段及消化道部位不同而异（方磊涵等，2017;茹文红等，2018;佟延南等，2018）。有关益生菌对仔猪肠道微生物群落的影响目前已有较多报道（Estrada et al.，2001;Huang et al.，2004;黄怡等，2012;Liu et al.，2014;Chiang et al.，2015），但鲜见针对哺乳期仔猪结肠整体微生物群落影响的研究报道。【拟解决的关键问题】应用Illumina Miseq高通量测序技术对肠道微生物16S rRNA文库进行测序，分析屎肠球菌（Enterococcus faecium）活菌对哺乳期仔猪结肠微生物群落优势门属的持续影响，为揭示益生菌调节仔猪肠道健康的作用机制及人为调控仔猪肠道菌群促进其健康提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

屎肠球菌分离自健康仔猪空肠黏膜，由浙江大学动物科学学院微生物与基因工程实验室提供。新生健康杜长大仔猪6窝，共62头，平均体重1.51±0.03 kg/头，由广西贵港市西江千秋种猪场提供。主要试剂：MRS培养基购自杭州奕成生物科技有限公司;TLANamp Stool DNA试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司;Nextera XT Index Kit v2购自美国Illumina公司。主要仪器设备有超低温冰箱、高速冷冻离心机、高压蒸汽灭菌器、实体显微镜和紫外可见分光光度计等。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 屎肠球菌制剂制备 培养至对数生长期的屎肠球菌在4 ℃下4000 r/min离心15 min，弃上清液，沉淀用磷酸缓冲盐溶液（pH 7.4）洗涤3次，再以无菌10%脫脂乳溶液调整活菌细胞数至1×108 CFU/mL，4 ℃保存备用。

1. 2. 2 试验仔猪分组及样本采集 将6窝仔猪随机分为对照组和益生菌组，每组3窝，每窝10～11头。从出生当天起，对照组新生仔猪每天灌服10%灭菌脱脂乳液10 mL/头，益生菌组新生仔猪灌服屎肠球菌制剂10 mL/头，持续灌服6 d。以常规方法饲养管理仔猪，自7日龄起饲喂教槽料，21日龄断奶。于停止灌服屎肠球菌制剂第2 d（7日龄）和第14 d（21日龄）清晨，分别从每窝试验仔猪中选出中等体重的仔猪各1头，放血屠宰，无菌剖解取出肠道，剪取结肠并收集结肠内容物，放入无菌冷冻试管内，暂存于液氮罐中。采样结束后迅速转存至-80 ℃冰箱，备用。

1. 2. 3 仔猪结肠内容物细菌基因组DNA提取 参照TLANamp Stool DNA试剂盒说明提取试验仔猪结肠内容物细菌基因组DNA，采用紫外可见分光光度计检测DNA浓度和纯度，以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。

1. 2. 4 菌群结构高通量测序 以细菌通用引物341f（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805r（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）扩增仔猪结肠内容物细菌16S rRNA全序列（Herlemann et al.，2011）。PCR反应体系50.0 μL：2×Phanta Max Master Mix 25.0 μL，DNA模板1.0 μL，341f/805r引物各2.0 μL，ddH2O 20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，进行25个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃终止反应。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，再次进行PCR扩增以添加特异性标签序列。PCR反应体系50.0 μL：2×Phanta Max Master Mix 25.0 μL，DNA模板5.0 μL，Nextera XT Index上、下游引物各2.0 μL，ddH2O 16.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，进行8个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃终止反应。将构建好的肠道微生物16S rRNA文库送至杭州晶佰生物技术有限公司，在Illumina Miseq测序平台上对V3～V4可变区域进行测序。

1. 2. 5 测序数据的生物信息学分析 测序原始数据以双端FASTQ格式保存（http：//en.wikipedia.org/wiki/Fastq），使用FLASH v1.2.7（http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）进行数据拼接，要求读长序列1和读长序列2的重叠不小于10 bp，不允许碱基错配，并利用特异性引物信息去除测序产物中的非特异性扩增片段;然后采用拼接软件PANDAseq v2.9和去嵌合体软件USEARCH对有效序列进行过滤，去除不含引物、不可拼接（pandaseq overlap≥10 bp）、平均Q值小于Q20、含有模糊碱基N及长度≤300 bp的序列。最后，使用QIIME中“addqiimelabels.py”命令对所有样品序列进行整合，根据97%的序列相似度对运算分类单位（OTU）进行聚类分析;同时采用“pick open referenceotus.py”命令在Greengenes v13.08数据库中提取OTU，并进行分类（最小分类至属）。采用QIIME中的“alphararefaction.py”分析菌群α多样性，以评价试验仔猪肠道微生物群落物种的丰富度、多样性及样品中序列被测出的概率。

1. 3 统计分析

采用SPSS 17.0对试验数据进行统计，并采用t检验进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2. 1 仔猪结肠内容物样本测序及聚类分析结果

仔猪结肠内容物样本经高通量测序获得长度大于300 bp的高质量序列共658679条，平均每个样本36593条。根据97%的序列相似度进行聚类分析，结果得到219个OTUs，其中，99.54%的OTUs可准确分类到19个门，58.45%的OTUs可准确分类到128个属。

2. 2 屎肠球菌对哺乳期仔猪结肠微生物群落α多样性的影响

采用QIIME计算菌群丰富度指数（Chao1）、菌群多样性指数（Simpson）、观察物种数（Observed- species）和菌群覆盖指数（Goods_coverage），分别对7和21日龄仔猪结肠微生物α多样性进行分析。与对照组相比，益生菌组仔猪结肠微生物群落的Chao1、Simpson和Observed-species指数均呈增加趋势，但未达显著差异水平（P>0.05，下同），说明屎肠球菌不影响哺乳期仔猪结肠微生物群落α多样性。此外，对照组和益生菌组仔猪结肠微生物群落Goods_coverage指数均达0.98，非常接近于1.00，表明样本序列被测出的概率很高，即测序结果能反映样本的真实情况。

2. 3 屎肠球菌对哺乳期仔猪结肠微生物门水平群落组成及其丰度的影响

哺乳期仔猪结肠微生物群落由19个门组成，且7和21日龄仔猪结肠微生物群落均以拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）占绝对优势，二者的相对丰度之和分别超过80%（7日龄）和90%（21日龄）。相对丰度在1%以上的还有变形杆菌门（Proteobacteria）和疣微菌门（Verrucomicrobia），但疣微菌门仅在7日龄对照组仔猪结肠微生物群落中占较大比例。本研究重点分析屎肠球菌对相对丰度大于1%各优势门的影响，结果（表1）显示，与对照组相比，益生菌组7日龄仔猪结肠微生物群落各优势门的相对丰度均有不同程度变化，但差异不显著（P>0.05，下同）;益生菌组21日龄仔猪拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度与对照组相比也无显著差异，但变形杆菌门相对丰度呈显著增加趋势。说明屎肠球菌对哺乳期仔猪结肠菌群优势门丰度的影响需在21日龄后才明显表现。

2. 4 屎肠球菌对哺乳期仔猪结肠微生物属水平群落组成及其丰度的影响

哺乳期仔猪结肠微生物群落由128个属组成，相对丰度超过1%的优势属在7日龄仔猪结肠微生物群落中有14个（表2）、21日龄仔猪结肠微生物群落中有12个（表3）。本研究主要分析屎肠球菌对仔猪结肠微生物群落优势属相对丰度的影响，结果（表2）表明，在7日龄仔猪结肠微生物群落中相对丰度较高的前10个属依次为拟杆菌属（Bacteroides）、阿克曼菌属（Akkermansia）、乳杆菌属（Lactobaci-llus）、普雷沃氏菌属（Prevotella）、颤螺旋菌属（Osci-llospira）、罗斯氏菌属（Roseburia）、韦荣氏菌属（Vei-llonella）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、梭菌属（毛螺菌科）[Clostridium（Lachnospiraceae）]和丁酸单胞菌属（Butyricimonas），其中90%属于拟杆菌门和厚壁菌门，进一步证实拟杆菌门和厚壁菌门在仔猪结肠微生物群落组成中的绝对优势地位。与对照组相比，益生菌组7日龄仔猪结肠微生物群落中相对丰度变化明显的优势属均隶属于拟杆菌门，其中，普雷沃氏菌属相对丰度显著增加，而拟杆菌属相对丰度极显著减少（P<0.01，下同），丁酸单胞菌属相对丰度显著减少。此外，厚壁菌门、变形杆菌门和疣微菌门绝大部分优势属的相对丰度呈减少变化趋势。可见，屎肠球菌对仔猪结肠微生物群落产生的直接影响是调节拟杆菌门相对丰度。

由表3可知，在21日龄仔猪结肠微生物群落中丰度较高的前10个属依次为普雷沃氏菌属、普雷沃氏菌属#、巨型球菌属（Megasphaera）、颤螺旋菌属、乳杆菌属、p-75-a5、拟杆菌属、产琥珀酸菌属（Succiniclasticum）、粪杆菌属（Faecalibacterium）和考拉杆菌属。这些优势属75%隶属于厚壁菌门、25%隶属于拟杆菌门，进而决定这两个门在21日龄仔猪结肠微生物群落中的绝对优势地位。与对照组比较，益生菌组仔猪结肠微生物群落66.67%优势属的相对丰度呈减少趋势，其中以厚壁菌门4个属的变化尤其明显，即巨型球菌属相对丰度极显著减少，乳杆菌属、产琥珀酸菌属和粪杆菌属相对丰度显著减少。可见，21日龄仔猪结肠微生物群落中受明显影响的菌属及其所属门类与7日龄仔猪完全不同，但也说明屎肠球菌对哺乳期仔猪结肠微生物群落组成的影响存在持续性。

3 讨论

厚壁菌门和拟杆菌门是哺乳动物正常肠道菌群的主要成员，在哺乳期仔猪粪便菌群中其占比分别为54.0%和38.7%，占据绝对优势（Alain et al.，2014）。本研究结果表明，7和21日龄仔猪结肠微生物群落均以拟杆菌门和厚壁菌门占绝对优势，二者的相对丰度之和分别超过80%（7日龄）和90%（21日龄），且屎肠球菌对这两个门类的相对丰度无显著影响，说明试验仔猪结肠微生物群落结构正常。在属分类水平上，断奶前仔猪肠道以乳杆菌属、拟杆菌属、普雷沃氏菌属和瘤胃球菌属占优势（Eyeraert et al.，2017），在本研究中再次得到证实。拟杆菌属和普雷沃氏菌属是拟杆菌门最主要的两个属，但其在肠道微生物群落中的数量极易受膳食成分变化的影响，且二者相互拮抗（Gorvitovskaia et al.，2016）。拟杆菌属细菌可在母体分娩时传递，因此是哺乳期肠道微生物群落的最初成员（Reid，2004），且与动物蛋白及饱和脂肪的饮食有关，具有特定的碳水化合物酶;但该属中某些菌种是毒力很强的致病菌，如脆弱拟杆菌（B. fragilis）、多形拟杆菌（B. thetaiotaomicron）和吉氏拟杆菌（B. distasonis）能引发炎症性肠炎腹泻或菌血症等疾病（Boquet et al.，1998）。丁酸单胞菌属的部分菌株也是致病菌，如绿色丁酸单胞菌（B. virosa）可引起菌血症（Ulger Toprak et al.，2015）;而普雷沃氏菌属细菌能分解纤维素产生短链脂肪酸，保护结肠而有益于宿主健康（De Filippo et al.，2010）。综上所述，尽管本研究得到的OTU分类仅准确到属，未能确定其菌种，但由研究结果可知新生仔猪灌服屎肠球菌后能促进有益于结肠健康菌属的生長，而抑制具有潜在致病性菌属的增殖。该结论为今后定向研究调控仔猪肠道健康的肠道共生微生物提供明确范围。

本研究结果与陈曦等（2016）的研究结果存在明显差异，究其原因可能是研究对象的生理阶段、饲养条件、样本采集部位及菌株不同所致。屎肠球菌在停止灌服2周后仍能显著影响仔猪结肠微生物群落，说明其对仔猪结肠微生物群落呈持续影响，可能与屎肠球菌活菌可在仔猪肠道中定殖生长有关（黄怡等，2016）。此外，7和21日龄仔猪结肠微生物群落中受屎肠球菌调节的门和属不同，推测与仔猪日龄对肠道微生物群落的影响有关。因为随着仔猪日龄的增长，其肠道微生物群落结构包括优势门和属的相对丰度均会发生改变（Kim et al.，2011;Alain et al.，2014;Eyeraert et al.，2017）。本课题组前期研究证实屎肠球菌能有效减少哺乳期仔猪的腹泻率（黄怡等，2012;李媛媛等，2018），但受屎肠球菌调节的菌属与仔猪腹泻率下降是否关联有待进一步探究。

4 结论

新生仔猪口服屎肠球菌能对其结肠微生物群落优势门或属组成产生持续影响，表现为促进有益于结肠健康菌属的生长，而抑制具有潜在致病性菌属的增殖，为今后定向研究调控仔猪肠道健康的肠道共生微生物提供明确范围。

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（責任编辑 兰宗宝）