王兵 廖勇仕 谢娟 邓杰 陈平 郭英

【关键词】 胶质瘤;电压门控氯通道3;侵袭; 迁移

Chloride channel-3 promotes invasion and migration of glioma cells Wang Bing， Liao Yongshi， Xie Juan， Deng Jie， Chen Ping， Guo Ying. Department of Neurosurgery， the Second Hospital， University of South China， Hengyang 421001， China

【Abstract】 Objective To investigate the expression and effect of chloride channel-3 （CLC-3） on the invasion and migration of human glioma cells.  Methods Immunohistochemical staining was adopted to detect the expression of CLC-3 protein in the pathological sections of 30 glioma patients with complete data and brain specimens from 6 non-glioma normal subjects. The expression of CLC-3 in the U87MG cell lines was down-regulated by ShCLC-3 interfering adenovirus. The invasion and migration of glioma cells were detected by Transwell invasion and migration assay. The detection results were statistically analyzed.  Results According to the pathological grading criteria of glioma by WHO， 6 cases were classified as grade Ⅰ， 9 cases of gradeⅡ， 7 cases of grade Ⅲ and 8 cases of grade Ⅳ. CLC-3 was stained as yellow or brown in the high-grade glioma （grade Ⅲ-Ⅳ）， light yellow or yellow in the low-grade glioma （grade Ⅰ-Ⅱ）. In the normal brain cells， CLC-3 was not stained in 1 case， and light yellow in the remaining 5 cases. The expression of CLC-3 protein was not significantly correlated with gender or age （both P > 0.05）. Spearman rank correlation analysis demonstrated that the expression of CLC-3 was positively correlated with WHO pathological grading of glioma （rs = 0.782， P < 0.001）. The expression of CLC-3 was significantly down-regulated in U87MG cells after the cells were infected by the ShCLC-3 adenovirus， and the invasion and migration abilities of glioma cells were significantly reduced （both P < 0.05）.  Conclusions CLC-3 is highly expressed in the pathological specimens of glioma， which is positively correlated with pathological grading of glioma. CLC-3 can promote the invasion and migration of glioma cells.

【Key words】 Glioma;Chloride channel-3;Invasion;Migration

胶质瘤是中枢神经系统中最常见的和高侵袭性的原发性恶性肿瘤，即使联合手术、放射治疗和化学治疗等综合治疗，胶质瘤患者的预后仍然很差。恶性程度最高的胶质母细胞瘤（GBM）的中位生存期为12 ～ 15个月[1]。导致胶质瘤患者预后不良的主要原因是其高度侵袭性，目前分子机制仍未清楚[2]。最近的研究表明离子通道在肿瘤的恶性生物学行为中发挥了重要作用。电压门控氯通道3（CLC-3）是CLC家族的成员之一，被认为是容积调节性氯通道的重要组分部分，广泛参与细胞容积调节、细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移、炎症反应等多种病理生理过程[3-5]。CLC-3在鼻咽癌、宫颈癌等多种肿瘤中的作用已被证实[6]。近年来有关胶质瘤与CLC-3的研究亦有报道，但CLC-3在不同病理级别胶质瘤中的表达及作用仍未明确。在本研究中，笔者通过检测30例不同病理级别胶质瘤标本中CLC-3的表达，以及分析短发夹靶向人CLC-3序列（ShCLC-3）干扰腺病毒下调胶质瘤细胞株CLC-3表达后胶质瘤细胞侵袭迁移情况，以明确CLC-3在不同级别胶质瘤中的表达及CLC-3在胶质瘤侵袭迁移中的作用，以期为CLC-3作为胶质瘤治疗的靶标提供理论基础。

材料与方法

一、主要试剂

CLC-3单抗（英国Abcam公司）、胶质瘤细胞系U87MG和SNB19（ATCC， Microbix公司）、生物素化羊抗兔二抗（美国Vector Laboratories）、SP法免疫组化试剂盒（中国中衫金桥）、DAB显色试剂（美国DAKO公司）、50×EDTA修复液（美国DAKO公司）、Triton-Xl（北京泰泽瑞达公司）、苏木素染色剂（美国DACO公司）、柠檬酸抗原修复工作液（北京中衫金桥公司）、Trizol试剂（美国Invitrogen公司）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、BGA蛋白浓度测定试剂盒（中国碧云天）、PVDF膜（美国Pierce公司）、ECL（美国Pierce公司）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（中国碧云天）、考马斯亮蓝快速染色液（中国碧云天）0.1 % Fibronectin（美国Sigma公司）、BSA（美国Amresco公司）、RPMI1640（美国HyClone公司）、HEPES（美国Sigma公司）、胎牛血清（美国HyClone公司）、PVDF膜（美国Pierce公司）Transwell小室（膜）（美国，Transwell）。

二、材 料

选取于中山大学附属第三医院神经外科通过手术切除的30例临床及病理資料完整的胶质瘤患者的石蜡包埋标本，其中男19例、女11例，年龄（52.0±13.6）岁。所有患者术前未接受任何放射或化学治疗。按WHO胶质瘤病理分级标准进行分级：Ⅰ级6例（毛细胞型星形细胞瘤）、Ⅱ级9例（弥漫型星形细胞瘤）、Ⅲ级7例（间变型星形细胞瘤）、Ⅳ级8例（原发性胶质母细胞瘤）。另选取于中山大学附属第三医院因外伤或出血行开颅手术的6例患者的正常脑组织标本（由手术入路获得）作为对照。胶质瘤组织和对照组织经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，连续切片，制成4 mm

厚片备染。所有标本行苏木素-伊红染色（HE染色）确认后行免疫组织化学（免疫组化）检测。所有标本均经2位病理科医师检测确诊。本研究获得中山大学附属第三医院伦理委员会的批准。

三、免疫组化

使用标准链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物方法进行免疫组化染色。染色结果通过显微镜观察10个高倍镜视野，根据表达阳性细胞数量及着色深浅判断染色强度，染色强度评分：无着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3;阳性细胞比例评分阴性为0分，≤25%为1分，26% ～ 50%为2分，51% ～ 75%为3分，≥76%为4分。每例细胞染色积分=染色强度评分+阳性细胞比例评分。按照积分分值可将表达程度分为：阴性（-）0 ～ 1分;弱阳性（+）2分;中度阳性（++）3 ～ 4分;强阳性（+++）5 ～ 7分。弱阳性、中度阳性及强阳性表达合称为阳性表达。结果由2位病理科医师独立评估确认。

四、细胞培养

胶质瘤细胞株U87MG在含5%胎牛血清的RPMI1640培养基中，于5%二氧化碳、37℃培养箱培养1周，传代2 ～ 3代。

五、沉默CLC-3表达腺病毒ShCLC-3的构建

ShCLC-3（NM_00124 3374.1）为5’-CCACGACUGGUUUAUCUUUCUCAAGAGAAAAGAUAAACCAGUCGUGG-3’。对照加扰序列为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUUUCAAGAGAACGUGACACGUUCGGAGAA-3’。通过使用AdEasy系统（MP Biomedicals Inc.）产生高滴度的重组腺病毒感染胶质瘤细胞株U87MG以敲低CLC-3的表达并通过蛋白免疫印迹检测构建效果。

六、Transwell细胞迁移和侵袭实验

将胎牛血清培养基中的细胞（2×104）添加在BioCoatTM侵袭室（BD）的上室中（分为腺病毒干扰CLC-3组及空病毒载体组），并在37℃孵育20 h，随后除去细胞内的细胞上部室与棉花棒。用甲醇固定在膜底部表面上迁移和侵入的细胞，用1%结晶紫染色并使用光学显微镜在放大倍数×100的5个随机视野中计数。迁移实验过程与侵袭实验过程基本一致，不同的只是上室不需要铺以Matrigel胶。

七、统计学处理

采用SPSS 19.0处理数据，正态分布计量资料用表示，2组间比较采用独立样本t检验;等级资料用率表示，多组间比较用秩和检验;CLC-3的表达强度与WHO胶质瘤病理分级间的相关性采用Spearman秩相关分析。P < 0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、CLC-3在胶质瘤组织中的表达及与WHO胶质瘤病理分级的关系

高级别（Ⅲ ～ Ⅳ级）胶质瘤细胞的染色呈明显棕黄色或棕褐色，提示CLC-3高表达;低级别（Ⅰ ～ Ⅱ）胶质瘤细胞呈淡黄色或棕黄色，提示CLC-3低表达;正常脑细胞1例无着色，另外5例呈淡黄色，提示在正常脑细胞中CLC-3也呈低表达。在胶质瘤细胞中，CLC-3表达产物主要位于细胞膜和细胞浆，在细胞核亦可见阳性染色，见图1、表1。

上述结果提示CLC-3在胶质瘤细胞中高表达，进一步对CLC-3的表达量与不同WHO胶质瘤病理分级的相关性进行研究，CLC-3在不同级别胶质瘤细胞中的表达强度差异具有统计学意义（P < 0.001），见表2。进一步行Spearman秩相关分析结果显示CLC-3的表达与WHO胶质瘤病理分级呈正相关（rs= 0.782 、P < 0.001）。

二、抑制CLC-3表达对胶质瘤U87MG细胞的侵袭和迁移能力的影响

1. ShCLC-3腺病毒载体对胶质瘤细胞株U87-MG中CLC-3表达的影响

ShCLC-3腺病毒可明显抑制胶质瘤细胞株U87MG中CLC-3蛋白的表达水平，见图2。

2. 抑制CLC-3表达对胶质瘤细胞株U87MG侵袭和迁移能力的影响

抑制CLC-3表达后，通过Transwell 小室的细胞数量明显减少。进一步行细胞计数，空病毒载体组与腺病毒干扰CLC-3组侵袭和迁移细胞数量差异均有统计学意义（n = 6，t分别为20.684、24.245，P均< 0.05）。提示抑制CLC-3表达后胶质瘤U87MG细胞的侵袭和迁移能力减弱，见图3。

讨 论

CLC-3已被证实在多种实体肿瘤细胞中高表达，并与肿瘤的侵袭性相关。我们的研究表明CLC-3在胶质瘤中高表达，并与其病理分级呈正相关;抑制CLC-3的表达可使胶质瘤细胞株的侵袭和迁移能力减弱，提示CLC-3或可作为治疗胶质瘤的一种潜在靶标。

胶质瘤的生长与其他实体肿瘤不同，肿瘤细胞在颅内受限空间内沿脑组织间隙侵袭性生长，而瘤周是低渗水肿环境，暴露于这种低渗水肿环境下的细胞如果不能主动调节容积改变，就会发生持续性膨胀，表现出生长抑制，甚至发生细胞凋亡[7-8]。这些环境特点需要胶质瘤较其他实体肿瘤具有更强的细胞容积调节能力及形变能力。研究证实低渗环境下，星形胶质细胞仅可实现容积的部分恢复，而胶质瘤细胞可调节细胞恢复原有的甚至更小的容积[9]。原位图像显示侵袭的胶质瘤细胞通常呈现细长的纺锤形形态黏附于血管上[10]。细胞对容积的调节是通过细胞膜上离子通道和離子交换体来实现的[11]。作为细胞内、外液中最主要的阴离子，氯离子被认为是参与调节性细胞容积回缩过程的主要溶质，大多数细胞膨胀会导致氯通道的活化[12-13]。CLC-3，一种电压依赖性氯离子通道，主要分布于中枢神经系统，在胶质瘤细胞容积调节过程中发挥重要作用。临床中我们常看到胶质瘤瘤周水肿随着病理级别的升高而明显加重，低级别胶质瘤瘤周无明显水肿或仅有轻度水肿，高级别胶质瘤尤其是胶质母细胞瘤瘤周水肿非常明显。在低渗水肿环境下，胶质瘤细胞表现出很强的增殖和侵袭能力，其机制目前仍未清楚。我们的研究显示CLC-3在胶质瘤中高表达，高表达的CLC-3主要分布在细胞膜上，且与WHO胶质瘤病理分级呈正相关，高表达的CLC-3可促进胶质瘤的侵袭和迁移，提示CLC-3在其中发挥了重要作用，瘤周低渗水肿环境下的细胞膨胀可能是胶质瘤细胞CLC-3激活和高表达的启动因子。

CLC-3促进胶质瘤细胞侵袭和迁移的机制目前尚未清楚。研究表明CLC-3可通过调节细胞体积在细胞迁移和侵袭中起关键作用[6]。CLC-3介导氯离子的分泌以及水的排出，以实现细胞体积改变和形状适应，促进胶质瘤细胞侵入狭窄和曲折的细胞外空间。有研究显示，在胶质瘤细胞系和胶质瘤患者样本中，细胞膜上的CLC-3蛋白均上调[14]。CLC-3与大电导钙激活性钾通道（BK通道）共定位于胶质瘤细胞，BK通道是神经胶质瘤细胞钾离子流出的主要途径，其激活是胶质瘤迁移所必需的[10， 15]。这种共定位表明胶质瘤细胞协调的离子通道动态调节前导过程，促进细胞入侵。临床上常见的肿瘤周围脑水肿随着胶质瘤病理分级的增加而明显增加[16]。研究显示肿瘤周围脑水肿是影响胶质瘤发病率和病死率的重要原因[17]。目前仍缺乏合理的机制解释，我们的研究结果提供了一种新的分子机制解释。

综上所述，CLC-3在胶质瘤的侵袭迁移中发挥了重要作用，但其机制目前仍未清楚，是否仅通过调节细胞容积促进胶质瘤细胞侵袭和迁移，还是存在其他途径，我们的课题组将行进一步研究。

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（收稿日期：2019-01-11）

（本文編辑：洪悦民）