覃静林 张静 张军民

【关键词】 Fonsecaea monophora;色素;人巨噬细胞;THP-1单核细胞;炎症细胞因子

Effect of Fonsecaea monophora pigment on the expression of inflammatory cytokines in THP-1-derived human macrophages Qin Jinglin， Zhang Jing， Zhang Junmin. Department of Dermatology， Sun Yat-sen Memorial Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Zhang Junmin， E-mail： junminmx@ 163. com

【Abstract】 Objective To evaluate the effect of Fonsecaea monophora （F. monophora） pigment on the expression of inflammatory cytokines in THP-1-derived human macrophages.  Methods THP-1 human monocytes were induced into macrophages and co-cultured with the standard， pigment and albino strains of F. monophora. The expression levels of CD14 and CD68 on the cell membrane surface were quantitatively detected by immunofluorescence. Real-time quantitative PCR was performed to detect the expression of IL-1β，TNF-α， IL-6， IL-10 and TGF-β in each group.  Results After the induction of THP-1 human mononuclear cells into macrophages， the expressed membrane surface molecule was changed from CD14 to CD68. After co-culture with F. monophora， the expression levels of IL-6， IL-10 and TGF-β were significantly up-regulated in the standard strain （all P < 0.05）. The expression of IL-6 and TGF-β was remarkably up-regulated in the pigment strain （both P < 0.05）. The expression levels of IL-1β， TNF-α， IL-6 and IL-10 were significantly up-regulated in the albino strain （all P < 0.05）. The expression of IL-1β in the albino strain was significantly higher than that in the standard strain （P < 0.05）. The expression levels of IL-10 and TGF-β were significantly up-regulated in the standard strain compared with those in the pigment and albino strains （all P < 0.05）.  Conclusions The standard strain of F.monophora can promote the development of human macrophages into the anti-inflammatory state. The albino strain can accelerate the progression of human macrophages into the pro-inflammatory state， whereas the pigment strain can maintain human macrophages in the balance state between pro-inflammatory and anti-inflammatory state， indicating that F. monophora pigment may lead to the disorder of inflammatory state of the host.

【Key words】 Fonsecaea monophora;Pigment;Human macrophage;THP-1 monocyte;

Inflammatory cytokine

着色芽生菌病（CBM）由暗色孢科中的一组特殊暗色真菌导致的一种慢性进行性皮肤和皮下组织肉芽肿性真菌病，是最常见的植入性真菌感染病之一。病原菌通过皮肤破损处进入宿主体内，最常发生于下肢，多发于从事农、林及畜牧业的体力劳动者。该病进展缓慢，病程可达数十年，治疗困难且易复发，部分患者发病部位可以发生癌变，使患者丧失工作能力甚至威胁患者生命，严重影响患者生活质量。该病于2017年被世界卫生组织正式纳入“被忽略的热带病”范畴，以此呼吁全球专家重视[1]。在我国，CBM发生地域主要位于山东及两广地区[2-3]。很多研究表明CBM的重要致病因子是黑色素、硬壳细胞、细胞黏附性和疏水性[1]。

Fonsecaea monophora（F. monophora）是从多株F. pedrosoi着色霉菌株中发现的一个新种，是我国南方地区CBM的主要致病菌[4-5]。该菌不仅可以造成局限性皮肤感染，也可引起系统性感染，侵犯神经系统或呼吸道，具有噬神经性，正如隐球菌一样，严重者危及患者的生命健康[6-7]。尽管很多学者致力于CBM发病机制的研究，但到目前为止，F.monophora的致病机制并不十分清楚。

在不同的微环境下，巨噬细胞可被刺激产生不同的炎症细胞因子，当处于促炎状态时，可分泌IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎症细胞因子，清除和杀伤入侵的病原菌，抑制周围细胞的增殖和破坏组织的完整性，当处于抗炎状态时，可分泌IL-10、转化生长因子-β（TGF-β）等抗炎症和促修复细胞因子，促进细胞的增殖和组织修复，导致疾病慢性化[8-9]。以往的相关体外研究大多数是在小鼠巨噬细胞层面进行。然而，F. monophora对人巨噬细胞的影响，尤其是F. monophora色素对人巨噬细胞炎症细胞因子表达的影响，暂未见文献报道。

材料与方法

一、细胞和菌株

人单核细胞系THP-1细胞购自武汉大学中国典藏物保存中心。F.monophora标准株（CBS269.37，SUMS0310）受赠于荷兰微生物菌种保藏中心，既有孢子成分又有菌丝成分，含色素;F. monophora 色素株（CBS122845，SUMS0505）分离自一位81岁CBM患者的皮损，是一种分生孢子突变株，经形态学和内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列鉴定为F. monophora，含色素，无菌丝成分;F. monophora 白化株（CBS1 25149，SUMS0 510）是上述色素株在PDA培养基上转种10余次后得到的天然突变株，不含色素，无菌丝成分。

二、主要试剂

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA） （BD，美国）;RPMI-1640培养基（Gibco， 美国）;青霉素/

链霉素混合液（双抗）（Hyclone， 美国）;胎牛血清（Fetal Bovine Serum， FBS）（Gibco， 美国）; PBS缓冲液（1×）（Gibco， 美国）;丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）（Sigma， 美国）;6孔板细胞爬片（广州永津生物科技有限公司）;抗CD14抗体（Servicebio， 中国）;抗CD68抗体（Servicebio， 中国）;Trizol RNA提取试剂（TaKaRa，大连宝生物工程有限公司）;TB GreenTM  Premix Ex TaqTM  Ⅱ（TaKaRa， 大连宝生物工程有限公司）;PrimeScriptTM RTMaster Mix（TaKaRa， 大连宝生物工程有限公司）。

三、实验方法

1. 细胞复苏、传代及培养

在无菌超净台内，无菌操作复苏THP-1细胞株，用提前配置好的含10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养基在含5% CO2、37℃培养箱中培养2 ～ 3 d。经2 ～ 3次传代状态稳定后用Count Star细胞计数板调整细胞密度至6×105 /ml，转至6孔板。

2. 细胞免疫荧光

将实验分为2组：THP-1空白对照组和THP-1+PMA实验组，将细胞浓度调整为6×105 /ml，转种至铺好细胞爬片的6孔板中，每孔2 ml，加入PMA（100 ng/ml），在含5% CO2、37℃培养箱中共孵育48 h。空白对照组则将浓度为6×105 /ml的細胞悬液滴加到细胞爬片上，超净台内风干。在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min;用4%的多聚甲醛固定爬片15 min， PBS浸洗玻片3次，每次3 min;0.5% Triton X-100（PBS配制）室温通透20 min;PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min;吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加稀释好的一抗抗CD14（1∶300）和抗CD68（1∶500），并放入湿盒，4℃孵育过夜;PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗CY3-山羊抗小鼠（1∶300）和FITC-山羊抗兔（1∶500）（注意避光），湿盒中室温孵育1 h，PBST浸洗切片3次，每次3 min;滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI;用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

3. 制备F. monophora孢子悬液

将3种F. monophora分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基，26℃培养13 ～ 15 d后，用PBS缓冲液反复轻轻吹打菌落，制备菌悬液。以10 000转/分离心10 min，去上清，重复2次，PBS缓冲液重悬，血球计数板调整菌悬液的分生孢子浓度为6×107 CFU/ml，4℃冰箱保存备用。

4. 实验分组及共培养的建立

将实验分为4个组：空白对照组、标准株组、色素株组和白化株组。细胞传代2 ～ 3次，细胞状态稳定后将细胞浓度调整为6×105 /ml，转种到6孔板，每孔1.8 ml，加入PMA（100 ng/ml），在含5% CO2、37℃培养箱中共孵育6 h待细胞完全贴壁后以细胞∶孢子=1∶10的比例每孔加入提前配置好的菌悬液200 μl，在含5% CO2、37℃培养箱中继续培养42 h[10]。

5. 细胞和F. monophora观察

F. monophora与细胞共培养42 h后于相差倒置显微镜下观察细胞和F. monophora的变化并拍照记录。

6. 总RNA提取、逆转录及定量PCR

总RNA提取按照试剂说明书进行。逆转录及定量PCR反应均依据试剂盒说明进行。反应条件为：95℃预变性1 min;95℃变性 5 s，60℃扩增15 s并采集荧光信号，45个循环。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

以上实验均重复3次，定量PCR结果由Bio-Rad CFX Connect PCR扩增仪收集。PCR循环结束后，进行溶解曲线分析，以检验PCR反应的特异性。

四、统计学处理

使用进阶相对定量（advanced relative quant-ification）方法对扩增反应进行分析，根据扩增曲线得到Ct值，以2-△△Ct法分析进行组间相对定量分析。使用Graphpad Prism 5.0进行数据分析并作图。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、PMA可将THP-1人单核细胞诱导为巨噬细胞

在加入PMA诱导6 h后，细胞由悬浮状态转变为贴壁状态;与未被诱导的细胞相比，细胞体积增大，胞内吞噬泡增大增多，随着共孵育时间的延长，形态不再呈圆形，而是多边形，甚至出现触角。细胞膜表面分子由单核细胞高表达的CD14转变为巨噬细胞高表达的CD68（图1）。

二、F. monophora 不同菌株对巨噬细胞形态的影响

标准株与人巨噬细胞共培养42 h后，可以观察到孢子的继续生长繁殖并没有受到明显的影响，但同时可以观察到部分菌丝被巨噬细胞所包裹（图2B）;色素株和白化株与人巨噬细胞共培养42 h后，可以发现巨噬细胞聚集在孢子的周围，标准株的小孢子可被吞噬，但菌丝不可被吞噬;色素株和白化株的孢子由于體积较大，粘连成团，不能被吞噬（图2C、D）。

三、F. monophora色素对THP-1来源人巨噬细胞炎症细胞因子表达的影响

F. monophora标准株上调促炎细胞因子IL-6和抗炎细胞因子IL-6、IL-10、TGF-β的表达（LSD-t值分别为4.515、9.458、12.630，P均< 0.05），对促炎细胞因子IL-1β和TNF-α的表达有上调趋势，但差异尚无统计学意义（P均> 0.05）;色素株上调促炎细胞因子IL-6和抗炎细胞因子TGF-β的表达（LSD-t值分别为3.759、4.529，P均< 0.05），对促炎细胞因子IL-1β、TNF-α和抗炎细胞因子IL-10的表达有上调趋势，但差异尚无统计学意义（P均> 0.05）;白化株上调促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和抗炎细胞因子IL-10的表达（LSD-t值分别为5.118、3.448、6.705、3.922，P均< 0.05），对抗炎细胞因子TGF-β的表达有上调趋势，但差异尚无统计学意义（P > 0.05）。白化株较标准株能上调促炎细胞因子IL-1β的表达（LSD-t=3.807，P < 0.05）;标准株较色素株和白化株能上调抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的表达（LSD-t值分别为5.815、4.952、7.249、9.848，P均< 0.05），见图3。

讨 论

真菌细胞壁是真菌生存和致病的重要结构，包括葡聚糖、甘露糖、色素等成分，色素在细胞壁层形成不规则颗粒，通过与含甘露糖或葡聚糖的糖蛋白间形成共价链接而锚定在细胞壁上[11]。许多文献证实色素是真菌的重要毒力因子，参与调节宿主与真菌的免疫炎症反应。色素对宿主免疫的影响涉及炎症细胞迁移、吞噬、凋亡等多方面。很多研究证实了巨噬细胞在真菌色素-宿主相互作用中的重要性。烟曲霉色素通过改变巨噬细胞内吞噬体的pH值阻止其凋亡，而无色素变异株则不能修正这种pH值的变化，致使吞噬体在持续酸性环境里最终进入死亡阶段[12]。烟曲霉色素除了能屏蔽β葡聚糖从而影响病原分子模式识别外，还能通过移除细胞吞噬体内NAPDH氧化酶的亚单位、抑制NADPH氧化酶活性而抑制人单核细胞发生与LC3相关的自噬[13]。

真菌的色素除了抑制巨噬细胞内吞噬细胞的酸化、中性粒细胞迁移等免疫反应外，近期Rambach等（2015年）证实色素还有促进血小板活化、诱导颗粒释放等作用。F. pedrosoi色素被证实能够刺激IL-10分泌，并可下调宿主细胞吞噬率，推测色素可能是调节宿主免疫类型、形成维持感染的主要原因。研究表明F. monophora色素株及其细胞壁成分可以降低小鼠巨噬细胞（RAW264.7）诱导型一氧化氮合酶基因的表达，抑制一氧化氮在体外的合成，Th2细胞因子的表达增加，Th1细胞因子的表达被抑制，表明黑色素在体外避免氧化杀伤的过程中起着重要作用，Th2细胞因子的表达增加可能会加速真菌的持续存在[14]。此外，F. monophora 色素能够刺激BALB/c小鼠Th2 细胞因子的产生，下调Th1细胞因子的分泌，色素的存在对BALB/c小鼠产生的毒力较强，从而推测黑色素是F.monophora重要的毒力因子和保护因子[15]。在我们的研究中，F. monophora与THP-1来源的巨噬细胞共培养后，白化株较标准株能明显上调促炎症细胞因子的表达，标准株较色素株和白化株能明显上调抗炎症细胞因子的表达。F. monophora标准株由于既含有色素又有菌丝成分，其毒力更强，能促使人巨噬细胞往抗炎状态发展，抑制宿主对病原菌的清除和杀伤，白化株不含色素，毒力较弱，能促使人巨噬细胞往促炎状态发展，色素株则使人巨噬细胞处于促炎和抗炎的平衡状态，既不利于早期入侵宿主病原体的清除，也不利于宿主的后期修复。

综上所述，我们的研究初步表明F. monophora色素在人细胞水平上的毒力表现与鼠科水平基本一致。所以利用THP-1人单核细胞系来研究F. monophora的致病机制是可行的。同时，本研究首次成功构建了F. monophora不同菌株与THP-1来源的人巨噬細胞共培养体系，可为后续在人类细胞水平上进一步阐明CBM的发病机制及F. monophora 的致病机制和宿主防御机制奠定基础。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-01-12）

（本文编辑：杨江瑜）