马甜 龚含情 陈建波 罗永婷

摘要：本文研究了在2.0、3.5、4.5、7.4、8.8五种pH值条件下特拉匹韦与人血清白蛋白的相互作用。结果表明：pH值为7.4（即生理条件下）时，结合常数K出现最大值，由此可见pH7.4是特拉匹韦与人血清白蛋白相互作用的最适pH值。

关键词：特拉匹韦;人血清白蛋白;pH

【中图分类号】R-01    【文献标识码】A    【文章编号】2107-2306（2019）06-074-02

1 引言

血清白蛋白（Serum  albumin，SA）作为脊椎动物血浆中含量最丰富的蛋白质，是血液系统的重要组成部分，它具有结合与运输内源性物质、维持血液胶体渗透压及物质交换、 自由基清除、抗凝血及抑制血小板功能、影响微管渗透性等生理功能。

特拉匹韦是治疗慢性丙型肝炎病毒感染的一个新大陆，能够通过抑制NS3/4蛋白酶，攻击HCV来阻断病毒復制，在体内和体外都有抗HCV基因的活性。目前，特拉匹韦已经成为一个能够对治疗失败的丙肝患者产生疗效的药物，它的安全性高、用药时间短，能够减少长期用药带来的不良反应。

本文探讨了人血清白蛋白 （Human serum albumin， HSA） 在不同pH环境下与特拉匹韦的结合情况，比较了不同pH环境对二者结合程度的影响，提出理论最适pH条件，为特拉匹韦在临床的研究提供参考。

2 实验部分

2.1试剂与仪器

人血清白蛋白（纯度≥98.0%，上海源聚生物科技有限公司产品），特拉匹韦（纯度≥98.0%，上海源叶生物科技有限公司产品），氯化钠，氢氧化钠，Tris，盐酸均为分析纯试剂。

ZD-2pH计，DK-S24电热恒温水浴锅，Cary Eclipse荧光分光光度计，AL104电子分析天平。

2.2实验方法

用Tris和盐酸配成浓度为0.05mol/L、pH分别为2.0、3.5、4.5、7.4、8.8的 Tris-盐酸缓冲液，其中，用浓度为0.1mol/L的氯化钠维持溶液离子强度。用配制好的不同的pH缓冲液分别配制人血清白蛋白与特拉匹韦浓度比依次升高的溶液，浓度比分别为1：0、1：5、1：9、1：13、1：17、1：21。将溶液置于298K的恒温水浴锅中放置一段时间后，取出进行荧光测定。荧光光谱的测定：设置激发波长为280nm，发射和激发狭缝为5nm，扫描300～500nm内蛋白的发射光谱。探究不同pH条件对特拉匹韦与人血清白蛋白的相互作用的影响。

3 结果与讨论

3.1 pH7.4时特拉匹韦对人血清白蛋白荧光发射光谱的影响

5、9、13、17、21.  T=298K， pH=7.4.

图1显示的是生理条件pH 7.4时的荧光光谱图。随着特拉匹韦浓度的增加，人血清白蛋白在最大荧光发射波长（λem） 341nm处的相对荧光强度有规律地降低，同时荧光峰位略有红移，说明特拉匹韦对人血清白蛋白的荧光有猝灭作用， 且会使人血清白蛋白的疏水性减小，极性增加。二者存在着相互作用。

3.2不同pH条件下下特拉匹韦和人血清白蛋白的相互作用

本实验选取分别在2.0、3.5、4.5、8.8四种pH环境，且温度恒定为298K的条件下，通过pH对结合反应的影响的光谱图来判断不同pH值对特拉匹韦和人血清白蛋白相互作用的影响.图2为不同pH条件下特拉匹韦与人血清白蛋白相互作用的荧光发射光谱图。

（1） C（HSA）=1×10 mol/L ，（2-6）C （telaprevir） /C（HSA）：5、9、13、17、21.

由图2可知，特拉匹韦与人血清白蛋白结合的荧光峰随着pH条件的变化而略微移动，荧光强度也发生有所不同的变化，这说明，不同pH影响着特拉匹韦与人血清白蛋白的相互作用。

假设蛋白质与药物相互作用存在单一结合位点的情况，应用方程（公式（1）），可计算特拉匹韦和人血清白蛋白相互作用的结合常数。

其中，F为人血清白蛋白的初始荧光强度（即未加特拉匹韦时蛋白的荧光强度）;F为特拉匹韦-人血清白蛋白体系的荧光强度;[Q]为特拉匹韦的最终体系浓度。根据对作图，根据直线斜率可以求得特拉匹韦和人血清白蛋白的结合常数K。图3为不同pH条件下特拉匹韦和人血清白蛋白结合位点的双对数图，根据图中直线的斜率，由公式（1）计算求得结合常数K于表1中。

由表3数据可知，特拉匹韦与人血清白蛋白的结合可在不同pH环境下进行，结合常数随pH值的变化而发生改变，这是可能是因为不同的pH值环境影响了蛋白自身的构象，或者影响了特拉匹韦与蛋白质带电的情况。同时，由表1数据可知，当pH为7.4时，特拉匹韦与人血清白蛋白结合常数最大，这说明，pH7.4是特拉匹韦与人血清白蛋白结合的最适pH，也即生理环境的pH是特拉匹韦与人血清白蛋白结合的最适pH。

4 结论

本文运用荧光光谱法研究了特拉匹韦与人血清白蛋白的相互作用。求出特拉匹韦和人血清白蛋白的结合常数，直观反应并探讨了不同pH值对特拉匹韦和人血清白蛋白相互作用的影响。由表中数据可知，特拉匹韦和人血清白蛋白的结合常數较大，说明两者有较强的结合作用。推测人血清白蛋白起到储存和运输特拉匹韦的作用，并且参与机体的血液循环至作用部位。

结果发现不同pH值条件下，特拉匹韦均能与人血清白蛋白结合，但结合常数不同，这可能是因为蛋白质在不同pH值条件下的分子构象发生了改变或由于不同pH值下，特拉匹韦的解离度相同引起蛋白质带电不同进而可能影响到反应的结合常数。在四种pH值条件下，pH值为7.4（即生理条件下）时，结合常数Ka出现最大值，由此表明pH 7.4是特拉匹韦和与人血清白蛋白相互作用的最适pH值。实验结果可对特拉匹韦和人血清白蛋白相互作用的作用机理研究、临床研究和生物工程等领域提供重要的理论参考。

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基金项目：国家自然科学基金项目（21303105）资助