赵娜 苗艳梅 赵敏

摘要：植物的真菌病原菌可以通过核糖体RNA或者其他通用引物进行鉴定，植物病毒缺乏通用引物，这给植物未知病毒病的鉴定带来较大挑战。随着分子生物学及测序技术的发展，出现了很多直接从植物病料中检测未知病毒的方法，这些方法推进了植物病毒的发掘和病原鉴定，取得了非常好的效果。本文主要阐述近年来应用于检测未知植物病毒的分子生物学方法。

关键词：未知植物病毒：分子生物学：检测方法

中图分类号：$432.4+1 文献标识码：A 文章编号：1000-4440（2019）01-0224-05

对植物而言，植物病毒是仅次于真菌的第二大病原，由于其流行和爆发对粮食危害极大，且防治困难，故有植物癌症之称。据不完全统计，受植物病毒影响，全世界每年粮食总产量损失约10%。有关植物病毒的研究已有100多年历史，但大多数研究仅限于农作物中的疾病，有很多植物病毒未被发现。植物病毒结构特殊，而且没有通用的编码序列，这增加了植物病毒研究的难度，植物病毒的多样性仍是未知的，有待新的研究方法去揭秘。

植物病毒的传统检测方法主要包括指示植物鉴别法、血清学试验法如酶联免疫吸附试验（ELISA）]、分子杂交技术法、电镜技术法。最近，随着分子生物学技术的迅猛发展，聚合酶链式反应（PCR）技术、基因芯片等已广泛应用于植物病原的鉴定中。但是，利用这些常用试验方法进行鉴定的前提是必须了解病原物的生物学特性和基因组特征。譬如，基因芯片技术可以一次性检测10种病毒，但只能检测未知病害植物中的已知病毒。这些方法对于植物未知病毒的挖掘以及植物新病害的诊断研究有很强的限制性，在实际工作中不易推广。由此可见，未知植物病毒的检测方法在新病毒发现方面发挥着十分重要的作用。本文重点阐述利用分子生物学技术检测未知植物病毒的研究现状。

1基于传统分子生物学技术的未知病毒检测方法

随着分子生物学技术的发展，出现了很多针对未知植物病毒的检测技术。由于植物病毒基因组结构较为简单，多为1个或者2个开放阅读框，且核酸会残存在发病植物病料中，故可以通过追踪、放大基因组本身的方法鉴定核酸序列，再与NCBI数据库中已知病毒序列进行比对，利用生物软件分析病毒生物学特征，确诊病原。现阶段，基于传统分子生物学的未知植物病毒检测方法主要有双链RNA（dsRNA）技术、cDNA代表性差異分析（RDA）技术、核酸序列非依赖性引物扩增技术等。

1.1 dsRNA技术

植物病毒基因组以RNA为主，占90%以上。双链RNA是RNA病毒、类病毒等在寄主体内形成单链核糖核酸（ssRNA）的特异复制中间型产物，具有病毒特异性，且性质稳定，不随寄主改变而改变。因此，提取植物组织或者病毒粒子中的dsRNA，可用于病毒种类鉴别，病毒侵染诊断。1986年Dale等首次从表现出典型症状的香蕉病株中分离得到dsRNA，并在以后的研究中确定存在于寄主植物韧皮部组织的病毒粒体为香蕉束顶病毒（BBTV）。现阶段，越来越多的研究者通过提纯dsRNA，提高样品中核酸的有效率，结合二代测序方法来检测未知病毒。同时，dsRNA的提取方法也在不断更新、完善，为植物病毒各个领域的研究提供技术保障。

1.2CDNA代表性差异分析技术

cDNA代表性差异分析技术建立在cDNA文库的基础上，通过提取患病和健康植物的总RNA，逆转录形成cDNA，对比患病植物与健康植物cDNA的差异，进行消减，减小文库规模，进而得到差异的cDNA序列，进行多次杂交，去除相同核酸，降低二次扩增背景的影响。战晴晴在构建柴胡全长cDNA文库时，虽然首次发现蚕豆萎蔫病毒2（BB—WV-2）可以侵染柴胡，但没有发现新病毒。总之，cDNA代表性差异分析方法较为繁琐、费时，且发现新病毒的几率较小。

此外，Cooper等利用高效液相色谱一串联质谱（HPLC-MS/MS）方法，通过分析差异表达蛋白质来鉴定植物感染的未知病原体。这种利用质谱法分析差异蛋白质的方法类似于cDNA代表性差异分析技术，但由于其数据的缺失值较多，获得结果的质量好坏以及可靠性高低参差不齐，给差异蛋白质的筛选造成了很大阻力。

1.3核酸序列非依赖性单引物扩增技术

核酸序列非依赖性单引物扩增技术（sISPA）是一种平末端连接扩增技术，原理如图1显示，起初仅用于检测DNA病毒，后来有学者采用改良的DNase-SISPA技术测定未知DNA和RNA病毒的序列，证实了该扩增方法对RNA病毒检测的有效性。由于该方法不需要提纯病毒，可以直接从病样中提取核酸，所以近年来越来越多的实验室通过此方法检测未知植物病毒。赵西梅通过提取dsRNA病毒，并以其为模板进行非序列依赖性PCR扩增，成功从有病症的地黄中分离到油菜花叶病毒（ORMV）和地黄花叶病毒（ReMV），从有病症的白术中分离出香豆萎葛病毒2号（BBWV2）。

1.4简并核苷酸引物扩增技术

简并核苷酸引物扩增技术（DOP）是通过巧妙设计引物来进行序列非依赖性扩增的，原理如图2显示，以3’端和5’端的特异性核苷酸序列以及中间6个核苷酸构成的随机引物为引物群.起初的引物是很随机的，但随着3’端引物上特异性核苷酸的结合，在随后的反应过程中，扩增产物的核酸匹配度越来越高，产物通过测序比对，即可找到未知的植物病毒序列。Badillo等对叶脉有条纹状坏死而且顶梢和叶侧脉部变黄的番茄植株进行检测时，利用等轴不稳环斑病毒属（I/arv/rus）简并引物的方法进行扩增，最终获得番茄坏死条纹病毒（TomNSV）全基因组，基因组分析结果表明，该病毒是亚组2的新成员。Ciuffo等在调查叶片具有病毒样症状（花叶、畸形和坏死）的莴苣时，利用马铃薯Y病毒属（Potyvirus）外壳蛋白（CP）所设计的简并引物成功扩增出1种新病毒，暂命名为意大利莴苣坏死病毒（LINV），该病毒可以通过桃蚜非持久性方式进行传播。

Shahid等在鉴定黑莓黄脉病病原时，利用简并引物检测到一种新的双链DNA病毒，暂时称为黑莓病毒F（BVF），该病毒为杆状DNA病毒属（Bad-navirus）新成员。一种暂命名为金盏花花叶病（Ad-MV）的香石竹斑驳病毒属（Carmovirus）新成员是科研人员通过简并引物方法发现的。由于简并引物技术可操作性较强，耗时短、费用低，近年来在很多植物的未知病原鉴定中发挥重要作用。

2基于新型测序技术的未知病毒检测方法

上述几种未知病毒检测的最终结果都必须依靠核酸的Sanger测序技术，通过NCBI网站Blast比对最终确定病毒种类。第二代测序技术（NGS）的推出，打破了Sanger测序技术的瓶颈，进入高通量测序技术时代，为挖掘新的未知病毒提供了新思路。

NGS从2009年开始应用于植物病毒领域，该领域包括植物病毒的发现，基因组序列测定以及生态学和流行病毒学的研究。这种新检测技术的流程主要包括样品核酸的准备，核酸文库的构建，上机测序，生物信息学数据分析等基本过程。根据核酸样品的不同来源，可以将NGS技术分为2大类，其中一类以宏基因组为研究对象，另一类以siRNA（Small interfering RNA）为研究对象。

2.1基于宏基因组学的NGS

宏基因组学以特定生态环境中全部微生物的遗传信息为研究对象，来研究部分微生物的功能基因筛选以及微生物与环境或者个体之间的关系，样品中病毒核酸如何富集，即核酸的有效性是保证序质量的关键。利用NGS的宏基因组学对植物病毒的最早研究来自于英国学者Adams等，为了保证NGS测序质量，提高样品核酸的有效性，先将从蛇鞭菊中获得的病原分离物摩擦接种到千日红，再通过对宿主核酸消减杂交，构建cDNA，进行NGS，最终获得一个名为蛇鞭菊轻斑驳病毒（GMMV）的黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）新成员。同样，Green等13伽将病样分离物摩擦接种于本氏烟，从而提取有症状的本氏烟总RNA，构建cDNA文库，利用Illumi-na公司的NextSeq 500平台进行NGS，最终获得芜菁黄花叶病毒属（Tymovirus）的新成员，暂时命名为奎东茄褪绿花叶病毒（NarCMV）。

Tang等为了提高NGS病毒序列的检出率，先将病原分离物摩擦接种于本氏烟，提取本氏烟总核酸，利用脱氧核糖核酸酶I消除DNA，同时消减宿主的rRNA，利用消减后的RNA构建eDNA文库，基于454平台进行NGS，最终获得一个暂时命名为罂粟花叶病毒（OPMV）的全基因组序列。值得关注的是，根据RNA病毒中间体dsRNA的特征，Petrzik等通过直接提取样品中的dsRNA，大大减少宿主核酸的影响，构建文库，进行NGS，最终获得醋栗病毒A（cu-VA）。此外，为了进一步减少宿主核酸的影响，Pardi-na等直接从提纯的病毒颗粒中提取核酸，进行NGS，最终获得甘薯G病毒（sPVG）的全基因组序列。

2.2基于siRNA深度测序的NGS

siRNA是在RNA沉默机制中产生的一种具有序列特异性调控功能的分子。植物RNA沉默机制的主要功能之一是抗病毒。植物对病毒产生适应性免疫应答反应，会在被病毒侵染的植物细胞中产生与病毒相关的siRNA，这些siRNA可用于检测植物中的RNA和DNA病毒，甚至可用于检测一些结构新颖的类病毒。siRNA与已知病毒没有明显的序列相似性，因此，siRNA高通量测序技术不依赖于已知病毒信息，可以检测样品群体中的全部病毒信息，适用于新病毒的发现，为植物未知病毒研究开拓新的思路。

迄今为止，通过对siRNA进行NGS，检测植物未知病原分离物较成功的案例来自于li等的报道。他们提取有症状番茄样品中的siRNA，并进行深度测序，生物信息学分析结果表明，样品中含有马铃薯纺锤块茎病类病毒（PSTVd）、凤果花叶病毒（PepMV）和1种新的病毒暂时命名为番茄坏死矮化病毒（ToNSV）]。有学者采用siRNA深度测序技术，发现了2种蔷薇科植物内侵染的新病毒，即来自野蔷薇样品的玫瑰叶丛簇伴随相关病毒（RLRaV）和来自有果实开裂症状桃植株样品的桃裂果伴随相关病毒（Pc-FaV）。此外，陈莎利用小RNA深度测序技术对云南省和贵州省玉米病毒病进行检测，获得3种未知的RNA病毒[玉米黄化花叶病毒（MYMV）、玉米相关的形影病毒（MAUV）、玉米相关的整体病毒（MATV1）]和1种国内首次报道的DNA病毒留尼旺玉米线条病毒云南分离物（MSRV-YN）]。

3展望

植物病毒多样性的研究尚处于起步阶段，作物中新病毒的发现，野生植物中新病毒的潜在生态影响以及病毒在感染植物中的潜在作用，这些问题的解决都依赖于未知病毒检测技术的发展。综上所述，利用已有的基因組序列，设计各个病毒属所特有的简并引物进行扩增，这种方法操作简单、费用低，是研究人员发现新病毒的首选方法。由于病毒种类繁多，所以研究人员需要克服简并引物设计的困难。

NGS技术具有高效、快速、非序列依赖性的优势，革新了发现和鉴定病毒的方法，在短短5年时间内发现多种新病毒种类，但是NGS也有一定缺陷。首先，对于病毒滴度较小的病毒，二代测序技术往往会忽略该类病毒的存在：其次，NGS虽然可以发现传统方法难以发现的新病毒，但是它往往会忽略科赫法则，不能证明新病毒是导致病害的病原体;再次，对于较大规模的植物病毒种类普查项目，二代测序技术的成本昂贵。总之，单一的未知植物病毒分子生物学检测技术，难免存在局限性，所以在实际应用中，应根据样品和调查项目状况，有针对性地选择1种或者几种检测技术，才能有效挖掘更多未知的植物病毒。