廖娜　梁秋玲　高幸玲　陈洁　黄初冬　韦啟球

摘    要： 运用热回流提取法制备半枫荷总黄酮，通过单因素试验及正交试验考察总黄酮提取的最佳工艺.研究表明： 在热回流提取法提取半枫荷总黄酮的最优提取工艺条件为：乙醇浓度80%、料液比1∶50（g/mL）、提取时间为2 h、提取温度90 ℃，此条件下半枫荷总黄酮提取率为6.08%，RSD值为4.79%，表明该优化工艺稳定、可行、提取率高.

关键词：总黄酮;半枫荷;热回流法;正交试验

中图分类号：R284.2                DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2019.02.014

0    引言

半枫荷（Semiliquidambar cathayesis）是一种药用植物，具有舒筋活血、抗炎、祛风除湿等多种功效.半枫荷的根、茎、叶均可入药，由于其在民间用药疗效显著，生物活性和化学成分受到广大研究者的关注.据研究显示，半枫荷根中含有多酚、有机酸类、甾醇、维生素、酰胺[1]、三萜和鞣花酸衍生物等物质[2-3].在生物活性方面，半枫荷枝干多酚具有抗菌、抗氧化活性[4]，半枫荷根提取物具有镇痛、抗炎[5]、活血化瘀作用[6].

黄酮类化合物基本结构是二苯基丙烷（C6-C3-C6），是自然界的天然产物.由于具有抗菌[7]、抗病毒[8]、抗氧化、抗炎[9]、抗癌[10]等能力，是中草药的主要活性成分.目前，有关半枫荷的报导，主要集中在半枫荷根的提取物的生物活性和单体化学成分研究，而对其枝干及总黄酮成分关注甚少.本文以半枫荷枝干为原料，运用热回流提取法制备半枫荷总黄酮，通过单因素试验及正交试验考察总黄酮提取的最佳工艺.

1    材料与方法

1.1   材料、试剂与仪器

半枫荷枝干采自广西武宣，由戴月副教授和韦运东副教授鉴定;芦丁标准品（纯度： 98%），百灵威科技有限公司;T6新世纪紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;FA2004分析天平，上海舜宇平恒科学仪器有限公司;TDL-5000BR离心机，上海科学安亭仪器厂;其他试剂均为市售分析纯.

1.2   方法

1.2.1   标准曲线

参考文献[11-12]标曲的制作方法，稍加修改制作标准曲线.精密称量芦丁标准品10 mg，配制成      0.2 mg/mL的标准液.量取配制好的芦丁标准液1.25 mL、2.5 mL、3.75 mL、5.0 mL、6.25 mL、7.5 mL于25 mL的容量瓶中，分别加入0.7 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，静置6 min后加入0.7 mL 10% Al（NO3）3溶液，6 min后加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，定容至刻度，摇匀.15 min后于509 nm处测吸光度A.以吸光度A值为纵坐标，浓度（mg/mL）为横坐标作图.

1.2.2   半枫荷预处理

将粉碎好的半枫荷粉末用石油醚脱脂直至石油醚变为无色[13]，除去叶绿素等杂质，晾干.

1.2.3   半枫荷总黄酮的提取

称量约0.500 g的半枫荷粉末，加入乙醇溶液，在一定的条件下加热回流提取[14].提取完后晾至室温后，置于50 mL的离心管中，以4 000 r/min的转速离心15 min.吸取上清液至50 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀，即为半枫荷总黄酮的提取液.

1.2.4   金缕半枫荷总黄酮含量测定

精密移取半枫荷总黄酮的提取液1 mL，置于25 mL的容量瓶中，依次加入同上的5% NaNO2、10%    Al（NO3）3、1 mol/L NaOH，定容至刻度，摇匀.15 min后，于509 nm处测量吸光度A.提取率的计算公式如下：

[金缕半枫荷总黄酮提取率（%）=浓度×稀释体积×提取液体积×100取样体积×样品质量]

1.2.5   单因素分析

分别考察提取时间C（30 min、60 min、90 min、120 min、150 min），乙醇浓度A（50%、60%、70%、80%、90%），提取温度D（60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃），料液比B（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）等因素对半枫荷总黄酮提取率的影响.

1.2.6   正交试验分析

单因素试验结果表明，乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度对总黄酮提取率均有影响，因而采用上述4个因素为考察对象，以半枫荷总黄酮提取率为评价指标，設计正交试验L9（34），重复试验3次.正交试验因素水平表设计见表1.

1.2.7   数据处理

采用Excel 2010处理数据.

2     结果与讨论

2.1    标准曲线

以吸光度（y）对质量浓度（x）进行线性回归分析，得标准曲线回归方程为： y=10.829x+0.003 7， R2=0.999 7.试验结果见图1，结果表明，芦丁在0.005～0.060 mg/mL质量浓度区间与吸光度值具有很好的相关性.

2.2   单因素试验结果

2.2.1    提取时间对总黄酮提取率的影响

试验结果见图2，据图2可以看出，半枫荷总黄酮提取率在提取时间0.5～1.5 h时呈上升趋势，当提取时间为1.5 h时，半枫荷总黄酮的提取率最大，有可能是半枫荷样品粉末与提取溶剂接触更为充分，提取率逐渐增加.而后，随着提取时间延长，提取率降低，可能是杂质溶出量增多，而提取率呈现下降趋势，导致金缕半枫荷总黄酮溶解的量变少.

2.2.2    乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

图3表明，半枫荷总黄酮热回流提取率受乙醇浓度的影响很明显.当乙醇浓度逐渐增大时，半枫荷总黄酮提取率先是逐渐增高，而后降低.当乙醇浓度达到80%时，提取率达到最大值，可能是半枫荷总黄酮中水溶性黄酮的含量低于醇溶性黄酮的含量，导致当乙醇浓度到达80%后提取率反而呈下降趋势.

2.2.3    温度对总黄酮提取率的影响

随着提取温度的增加，半枫荷总黄酮提取率不断增加（图4），可能是温度的升高有利于黄酮类物质的溶出，当温度为80 ℃时达到最大值.但随着温度的升高，提取率略微下降，可能是因为温度过高，导致黄酮类化合物的结构被破坏或发生氧化.

2.2.4    料液比对总黄酮提取率的影响

随着料液比的增加，提取率在逐渐增加（图5），可能是溶剂的增加加快与半枫荷粉末的充分接触，使黄酮类化合物更快的溶出.当料液比为1∶40（g/mL）时，提取率不再增加.

2.3   正交试验结果与分析

以半枫荷总黄酮提取率为研究对象，运用正交试验原理考察、分析，试验结果见表2.极差分析结果显示，各因素对总黄酮提取率的影响大小依次为B>D>A>C，即料液比>提取温度>乙醇浓度>回流时间.因此，根据试验的结果，选择A2B3C3D3为最佳提取条件，即乙醇浓度80 %、料液比1∶50（g/mL）、提取时间为2 h、提取温度90 ℃.

2.4    验证试验

在乙醇浓度80 %、料液比1∶50（g/mL）、提取时间为2 h、提取温度90 ℃的试验条件下开展试验.试验结果表明（表3），正交试验确定的半枫荷总黄酮最佳提取工艺稳定、可行，半枫荷总黄酮含量高于多酚含量[4，15].

表2  正交试验表及试验结果

Tab.2  Orthogonal array design arrangement and experimental results

[实验号 A /% B /（g·mL-1） C /h D/°C  总黄酮提取率/% 1 70 1∶30 1.0 70 5.72  2 70 1∶40 1.5 80 5.37  3 70 1∶50 2.0 90 6.39  4 80 1∶30 1.5 90 6.08  5 80 1∶40 2.0 70 5.77  6 80 1∶50 1.0 80 6.11  7 90 1∶30 2.0 80 5.82  8 90 1∶40 1.0 90 5.59  9 90 1∶50 1.5 70 5.48  K1 17.48 17.62 17.42 16.97 - K2 17.96 16.73 16.93 17.30 K3 16.89 17.98 17.98 18.06 R   1.07   1.25   1.05   1.09 ]

3    結论

本文以乙醇浓度、料液比、时间、温度4个因素，应用热回流法进行单因素试验及正交试验，得到最佳提取条件：即乙醇浓度80%、料液比1∶50（g/mL）、提取时间为2 h、提取温度90 ℃.在该条件下，金缕半枫荷总黄酮提取率为6.08%，RSD值为4.79%，半枫荷总黄酮含量较高，可能是半枫荷的药用成分.本研究所优化的提取工艺稳定、可行、提取率高，可为半枫荷总黄酮的开发利用提供理论基础.

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Optimization of total flavonoids extraction from Semiliquidambar

Cathayesis by refluxing method

LIAO Na， LIANG Qiuling， GAO Xingling， CHEN Jie， HUANG Chudong， WEI Qiqiu*

（Health Science Center， Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545005， China）

Abstract： To optimize the total flavonoids extraction from Semiliquidambar Cathayesis， the total flavonoids of Semiliquidambar Cathayesis was extracted wih refluxing method using single factor and orthogonal test. The results showed with the optimum extraction technology of the reflux extraction method， under the condition of ethanol concentration 80%， material to liquid ratio 1∶50 （g/mL）， extraction time 2 h， and extraction temperature at 90 °C， the extraction rate of total flavonoids was 6.08%， and the RSD was 4.79%. Therefore， the optimum extraction process was stable， feasible and efficient.

Key words： total flavonoids; Semiliquidambar Cathayesis; fefluxing method; orthogonal test