张磊　何越峰　张莉　张腾飞　杨凯云　黄云超　谭慧

[摘要] 目的 探讨长链非编码RNA（lncRNA）DEANR1、INXS、ANCR、FENDRR等在肺癌中的表达。 方法 选取2018年1～6月昆明医科大学第三附属医院收治的54例肺癌患者，其中鳞癌、腺癌、肺小细胞癌分别为28、22、4例。经手术获取癌组织、癌旁正常组织、肺癌淋巴结转移组织，提取总RNA，并采用SYBR Green实时荧光定量PCR检测基因的RNA表达量。 结果 DEANR1、INXS、ANCR在癌组织中的相对表达量均高于癌旁正常组织（P < 0.05）。淋巴结组织中ANCR、INXS的相对表达量与ki-67呈正相关（r = 0.757，P = 0.049;r = 0.802，P = 0.030）。结论 DEANR1、INXS、ANCR在癌组织中的相对表达量均升高，可能在肺癌的发生发展中起到促进作用，ANCR、INXS在淋巴结中的表达与ki-67呈正相关，可能与肺癌淋巴结转移及不良预后有关。

[关键词] 肺癌;lncRNA;DEANR1;INXS;ANCR;FENDRR

[中图分类号] R734.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）06（c）-0009-03

Expression of long non-coding RNA DEANR1 and others in lung cancer

ZHANG Lei1   HE Yuefeng2   ZHANG Li1   ZHANG Tengfei1   YANG Kaiyun1   HUANG Yunchao1   TAN Hui1

1.The First Department of Thoracic Surgery， the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming   650500， China; 2.School of Public Health， Kunming Medical University， Yunnan Province， Kunming   650500， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of long non-coding RNA （lncRNA） DEANR1， INXS， ANCR， FENDRR in lung cancer. Methods The study included 54 patients with lung cancer admitted to the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University from January to June 2018， including squamous cell carcinoma， adenocarcinoma， and small cell lung cancer in 28， 22， 4 cases， respectively. The cancer tissue， the lymph node metastasis and the tissue adjacent to carcinoma of 54 cases of patients with lung cancer was used to detect the expression of these genes by the real-time fluorescence quantitative PCR. Results The expression levels of INXS and ANCR in cancer tissues were higher than those in adjacent normal tissues （P < 0.05）. The expression levels of ANCR and INXS in lymph node tissues were positively correlated with ki-67 （r = 0.757， P = 0.049; r = 0.802， P = 0.030）. Conclusion The increased expression of DEANR1， INXS and ANCR in cancer tissues may be a positive factor in the development of lung cancer. The expression of ANCR and INXS in lymph nodes is positively correlated with ki-67， which may be related to lymph node metastasis and poor prognosis of lung cancer.

[Key words] Lung cancer; lncRNA; DEANR1; INXS; ANCR; FENDRR

肺癌在世界上發病率及死亡率一直居高不下，其发生发展与多个基因的表达密切相关，长链非编码RNA（lncRNA）指的是一类转录本长度超过200 nt[1]但不编码蛋白质的RNA分子，研究发现在肿瘤组织中有异常的lncRNA表达谱，其表达和功能的异常经常导致疾病的发生，如乳腺癌、肝癌、结直肠癌等[2-4]。

有研究发现lncRNA DEANR1在调节内胚层分化中有重要作用[5]。文献[6]发现INXS在肾脏、肝脏、乳腺和前列腺肿瘤细胞系中含量比非肿瘤组织低5～9倍，揭示了INXS是诱导细胞凋亡的内源性lncRNA。在一项关于乳腺癌的研究中，发现ANCR基因在乳腺癌细胞中的表达较癌旁组织下调，ANCR抑制乳腺癌细胞的迁移和入侵，该基因可能是乳腺癌诊断及治疗的标志物[7]。研究发现FENDRR能够抑制非小细胞肺癌细胞（NSCLC）的恶性增殖[8]。肺癌作为人类死亡率最高的恶性肿瘤，笔者推测其中部分基因也可能与肺癌的增殖、凋亡、复发、转移等某个方面相关。

本研究纳入2018年1～6月昆明医科大学第三附属医院（以下簡称“我院”）收治的54例肺癌患者，经手术获取标本，采用荧光定量PCR技术检测肺癌组织、正常组织、纵隔淋巴结转移组织中DEANR1、INXS、ANCR、FENDRR基因的表达量，通过与临床观察指标综合分析，观察其与肺癌的发生发展是否有关，为下一步研究lncRNA基因谱与肺癌发生发展的机制奠定一定的实验基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

经我院医学伦理委员会批准，患者签署知情同意书后，收集2018年1～6月我院胸外一科住院患者行外科手术切除的肺癌组织、癌旁正常组织及淋巴结转移组织（正常组织与癌组织距离>3 cm），均经过病理确诊。术后组织细胞学病检结果出示后，确定组织分型，查询并收集病例资料。共收集样本54例，其中腺癌、鳞癌、小细胞癌分别为28、22、4例;年龄35～75岁，平均（55.86±8.67）岁;男38例，女16例;吸烟33例，占61.11%;饮酒22例，占40.74%;低、中、高分化程度分别为26、22、6例;P40有10例（-）、11例（+）;P63有15例（-）、12例（+）;TTF-1有15例（-）、13例（+）;CK7有10例（-）、11例（+）;ki-67（+）范围为1%～80%。

纳入标准：肺肿瘤患者经手术后取得组织学标本经病理确诊为鳞癌、腺癌或小细胞肺癌。

排除标准：①肺肿瘤患者不能行手术者;②手术未能同时获得癌组织、正常组织及淋巴结转移组织。

1.2 组织的收集和保存

取下组织10 min内将标本放入预先装有RNAlater（美国ambin公司，货号JC-009）溶液的试管内，先在 -4℃环境中放置8 h，然后放入-80℃冰箱内长期保存。

1.3 RNA提取和定量

利用TRIzol（康为世纪）提取总RNA，天根生化Quant One Step RT-PCR kit（KR113）（货号CW2569M）进行反转录，按说明书步骤操作。利用荧光定量检测试剂盒（FP402）（天根生化，货号CW0957M）对RNA进行实时荧光定量PCR，以β-actin作为内参，以-△△Ct值来表示组织中各个基因相对表达量。引物信息见表1。

1.4 统计学方法

统计数据后录入数据库，采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析进行三组之间的比较，使用LSD-t检验来比较任意两组间的差异，5个基因相对表达量与ki-67的关系采用Spearman等级相关，与P63、CK-7等相关性采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌组织、癌旁正常组织与肺癌转移淋巴结组织中lncRNA的表达

与正常组织比较，肺癌组织中DEANR1、INXS、ANCR的表达升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.2 基因的相对表达量与ki-67及CK-7、P63等临床指标之间的关系

在肺癌组织中，CK-7阳性组中ANCR、FENDRR相对表达量[（8.15±4.23）、（16.00±5.54）]显著高于CK-7阴性组[（16.00±5.54）、（13.43±2.14）]（P = 0.032、 0.025）;DEANR1在P63阳性组的表达量（10.28±1.29）显著高于P63阴性组（9.25±3.79）（P = 0.035）。通过Spearman等级相关分析，发现淋巴结组织中ANCR、INXS的相对表达量与ki-67呈正相关（r = 0.757，P = 0.049;r = 0.802，P = 0.030）。

3 讨论

lncRNA对癌症等疾病具有重要的治疗潜力，其结构、表达是许多疾病发生发展的基础[9]。目前，已有报道ANCR在骨肉瘤组织中高表达，ANCR的表达减少抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移[10]。在结直肠癌中，ANCR表达降低时，肿瘤细胞的侵袭能力显著下降[11]，但ANCR在肺癌中的作用尚不清楚。本研究中ANCR在肺癌组织中的表达高于正常组织（P < 0.05），在肺癌组织中ANCR在CK-7阳性组的表达量高于阴性组（P < 0.05），而CK-7在鳞状上皮中并不表达，主要用于腺癌的诊断，ANCR的表达量与ki-67呈正相关，ki-67与预后相关，是检测恶性肿瘤细胞增殖情况及恶性程度、判断肺癌预后的标志[12]。提示ANCR可能在肺癌的发生中起到癌基因的作用，并与肺癌淋巴结转移及不良预后有关，但其机制还需深入探索。

DEANR1在内胚层分化的调节中发挥作用，但它是否在肺癌中发挥作用鲜见文献报道。本研究中DEANR1在肺癌组织中的表达较正常组织高（P < 0.05），并且与免疫组化指标P63有关，P63参与癌细胞增殖分化，同时具有促进和抑制肿瘤生长两种作用[13]，在肺癌淋巴结转移组织中，P63阳性组的DEANR1表达量高于P63阴性组（P < 0.05），可能为今后本课题组进一步研究DEANR1在肺癌中的作用奠定基础。

INXS被发现是具有凋亡作用的新型内源性lncRNA，其在肾脏、肝脏、乳腺和前列腺肿瘤细胞中的表达量比非肿瘤组织中低5～9倍，INXS可能是诱导细胞凋亡的内源性lncRNA[5]。本研究中，INXS在肺癌组织中的表达高于正常组织（P < 0.05），与上述研究不同，可能与组织来源不同有关，也可能其在肺癌细胞中发挥着不同的作用，但还需扩大样本量进行进一步研究，在淋巴结组织中INXS的表达量与ki-67呈正相关（P < 0.05），有研究发现ki-67的阳性与恶性肿瘤的增殖、发展、转移及预后高度相关[14]，与本研究结果一致，提示INXS可能与肺癌淋巴结转移及不良预后有关，是癌症治疗中可能探索的靶点。

在肺癌相关研究中，FENDRR基因可能与非小细胞肺癌的发生和进展相关，但与转移无明显关系[15]。本研究中，FENDRR在各组织中的表达比较差异无统计学意义，但FENDRR在CK-7（+）組的表达量高于CK-7（-）组（P < 0.05），而CK-7阳性表达与乳腺、肺等组织腺癌的发生相关[16]，提示FENDRR可能与肺腺癌的发生有一定关系，但需进一步收集肺腺癌样本进行研究。

综上所述，本研究通过对肺癌组织、正常肺组织、肺癌淋巴结转移组织中DEANR1、INXS、ANCR、FENDRR基因的表达量进行检测，发现DEANR1、INXS、ANCR在肺癌组织中的表达上调，上述基因可能在肺癌的发生发展中起到促进作用，ANCR、INXS在淋巴结中表达与ki-67呈正相关，可能与肺癌淋巴结转移及不良预后有关。上述基因的表达情况可为今后肺肿瘤的诊断、治疗、预后评价提供新的思路。在今后的研究中，我们将扩大样本量，针对与肺癌相关的基因，对不同病理分型的肺癌进行进一步病因及机制相关的研究。

[参考文献]

[1]  Ponting CP，Oliver PL，Reik W. Evolution and functions of long noncoding RNAs [J]. Cell，2009，136（4）：629-641.

[2]  Gibb EA，Vucic EA，Enfield KS，et al. Human cancer long non-coding RNA transcriptomes [J]. PLoS One，2011，6（10）：e25915.

[3]  Taft RJ，Pang KC，Mercer TR，et al. Non-coding RNAs：regulators of disease [J]. J Pathol，2010，220（2）：126-139.

[4]  Silva JM，Perez DS，Pritchett JR，et al. Identification of long stress-induced non-coding transcripts that have altered expression in cancer [J]. Genomics，2010，95（6）：355-362.

[5]  Jiang W，Liu Y，Liu R，et al. The lncRNA DEANR1 facilitates human endoderm differentiation by activating FOXA2 expression [J]. Cell Rep，2015，11（1）：137-148.

[6]  DeOcesano-Pereira C，Amaral MS，Parreira KS，et al. Long non-coding RNA INXS is a critical mediator of BCL-XS induced apoptosis [J]. Nucleic Acids Res，2014，42（13）：8343-8355.

[7]  Li ZW，Dong MC，Fan DG，et al. LncRNA ANCR down-regulation promotes TGF-β-induced EMT and metastasis in breast cancer [J]. Oncotarget，2017，8（40）：67329-67343.

[8]  徐然，尚超，石文君.长链非编码RNA FENDRR对非小细胞肺癌细胞增殖及凋亡的影响[J].现代肿瘤医学，2016，24（17）：2667-2669.

[9]  Wapinski O，Chang HY. Long noncoding RNAs and human disease [J]. Trends Cell Biol，2011，21（6）：354-361.

[10]  Zhang F，Peng H. LncRNA-ANCR regulates the cell growth of osteosarcoma by interacting with EZH2 and affecting the expression of p21 and p27 [J]. J Orthop Surg Res，2017， 12（1）：103.

[11]  Yang ZY，Yang F，Zhang YL，et al. LncRNA-ANCR down-regulation suppresses invasion and migration of colorectal cancer cells by regulating EZH2 expression [J]. Cancer Biomark，2017，18（1）：95-104.

[12]  王旭晖，王嵩，田铁栓，等.Ki67、bcl-2、bax蛋白在非小细胞肺癌中的表达及预后价值[J].首都医科大学学报，2005，26（6）：744-746.

[13]  张莉萍，侯立坤，谢惠康，等.P63、P40、CK5/6在小细胞肺癌中的表达及其意义[J].中华病理学杂志，2015，44（9）：644-647.

[14]  Taheri ZM，Mehrafza M，Mohammadi F，et al. The diagnostic value of Ki-67 and repp86 in distinguishing between benign and malignant mesothelial proliferations [J]. Arch Pathol Lab Med，2008，132（4）：694-697.

[15]  徐晓艳，杜华，宝鲁日，等.非小细胞肺癌活检标本中CK7、TTF-1、NapsinA、CK5/6及p63的表达及其意义[J].诊断病理学杂志，2015，22（11）：688-691.

[16]  Koren A，Sodja E，Rijavec M，et al. Prognostic value of cytokeratin-7 mRNA expression in peripheral whole blood of advanced lung adeno-carcinoma patients [J]. Cell Oncol（Dordr），2015，38（5）：387-395.