罗婕　王京琼　谢丽娜　周寿红

[摘要] 目的 觀察有氧游泳运动对衰老大鼠海马中酸敏感离子通道（ASIC）表达的影响。 方法 选取雄性无特定病原体级SD大鼠36只，通过随机数字表法将其分为对照组、衰老模型组和衰老训练组，每组12只。衰老模型组大鼠腹腔注射D-半乳糖[150 mg/（kg·d）]，衰老训练组大鼠腹腔注射D-半乳糖[150 mg/（kg·d）]同时每天有氧游泳训练60 min，共12周，对照组大鼠给予等量的生理盐水腹腔注射。Morris水迷宫实验检测大鼠的空间学习和记忆能力。Western blot检测大鼠海马中ASICs的表达。 结果 与对照组比较，衰老模型组大鼠逃避潜伏期的时间和到达平台游过的距离均显著延长，而大鼠穿越平台区域次数和时间明显减少，海马中ASIC1a和ASIC1b的表达显著增加，ASIC4的表达显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。与衰老模型组比较，衰老训练组大鼠逃避潜伏期的时间和到达平台游过的距离均显著减小，大鼠穿越平台区域次数和时间明显增加，海马中ASIC1a和ASIC1b表达显著降低，ASIC4的表达显著增加，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 有氧游泳运动改善了衰老大鼠的学习和记忆能力，其机制可能与降低海马中ASIC1a和ASIC1b表达而增加ASIC4的表达有关。

[关键词] 有氧运动;游泳;衰老;学习记忆;海马;酸敏感离子通道

[中图分类号] R749;G804.55          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）06（c）-0012-05

Effects of aerobic swimming on the expression of acid-sensing ion channel of hippocampus in aging rats

LUO Jie1   WANG Jingqiong1   XIE Li′na2   ZHOU Shouhong3

1.College of Physical Education， Hu′nan First Normal University， Hu′nan Province， Changsha   410205， China; 2.College of Physical Education， Hu′nan International Economics University， Hu′nan Province， Changsha   410205， China; 3.Department of Physiology， School of Medicine， University of South China， Hu′nan Province， Hengyang   421001， China

[Abstract] Objective To observe the effects of aerobic swimming exercise on the expression of acid-sensing ion channel （ASIC） in aging rats. Methods Thirty-six male specific pathogen free （SPF） Sprague-Dawley （S-D） rats were divided into control group （C group）， aging model group （AM group） and aging swimming training group （AST group） by random number table method， with 12 rats in each group. The rats in AM group were administrated with D-galactose [150 mg/（kg·d）] by intraperitoneal injection for 12 weeks. After treatment with D-galactose [150 mg/（kg·d）] by intraperitoneal injection， the rats in AST group were taken 60 minutes of aerobic swimming exercise every day for 12 weeks. The rats in C group were administrated the same amount of saline by intraperitoneal injection. The spatial learning and memory ability of rats were tested by Morris water maze test. Expression of ASIC1a， ASIC1b， ASIC2a， ASIC2b， ASIC3 and ASIC4 in hippocampus of rats were measured by Western blot. Results Compared with C group， the time of escape latency and the distance of reaching the platform were significantly increased， the number and time to across platform were significantly decreased， expression of ASIC1a and ASIC1b in hippocampus was significantly up-regulated and expression of ASIC4 was significantly down-regulated in AM group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with the AM group， the time of escape latency and the distance to reach the platform were significantly decreased， the number and time to across platform were significantly increased， expression of ASIC1a and ASIC1b in hippocampus was significantly down-regulated and expression of ASIC4 was significantly up-regulated in AST group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The aerobic swimming exercise improves the learning and memory in aging rats， of which， the mechanism may be related with decrease of expression of ASIC1a and ASIC1b and increase of expression of ASIC4 in hippocampus.

[Key words] Aerobic exercise; Swim; Aging; Learning and memory; Hippocampus; Acid-sensing ion channel

随着我国人口老龄化程度的加剧，人口老龄化给社会带来的不利影响日益凸出。生物体发生衰老是一种无法避免的自然现象，衰老发生时机体各器官的功能进行性下降。脑衰老是机体衰老的重要部分，学习和记忆能力的降低是脑衰老的主要表现[1]。衰老的发生机制十分复杂，至今尚未阐明清楚，包括自由基学说、代谢紊乱学说、端粒异常学说、衰老遗传程序学说等[2-3]。如何提高老年人的学习和记忆能力，延缓衰老的进程是重要的研究课题。研究显示适当的运动可促进细胞的新陈代谢，提高免疫力，增强学习和记忆能力，延缓衰老，但是其机制尚不清楚[4-6]。酸敏感离子通道（acid-sensing ion channel，ASIC）在神经细胞上广泛表达，研究表明ASIC参与了学习和记忆过程，急性应激通过激活ASIC增强大鼠的学习记忆[7]。长时程抑制（long-term potentiation，LTP）是一种突触可塑性的重要表现形式，与学习记忆关系密切，研究发现ASIC1a是海马中产生代谢型谷氨酸受体依赖的LTP所必需的[8]。但是关于ASIC与学习记忆的关系也存在矛盾的结果，研究发现ASIC1a不是与学习记忆关系密切的LTP和空间记忆所必需的[9]。那么ASIC与学习记忆的关系到底是怎样的？有氧游泳运动改善学习和记忆的机制是否与ASIC有关？这些问题目前还不明确。因此本研究通过D-半乳糖诱导大鼠的衰老性学习和记忆损伤，通过有氧游泳运动训练，观察其对衰老大鼠学习和记忆能力及海马ASIC表达的影响，从ASIC的角度探讨有氧游泳运动改善衰老大鼠学习和记忆能力的可能机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Morris水迷宫设施由成都泰盟科技有限公司提供。BCA蛋白定量试剂盒购自美国Invitrogen公司。兔抗大鼠ASIC1a（货号：09-195）、ASIC1b（货号：07-673）、ASIC2a（货号：07-864）、ASIC2b（货号：05-174-S）、ASIC3（货号：6361-H）、ASIC4（货号：34372-2）、β-actin（货号：08-512-B）及抗辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Millipore公司。

1.2 动物

无特定病原体级的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠36只（实验动物合格证号：4300470038756），2月龄，体重（200±30）g，由中南大学实验动物学部[实验动物生产许可号：SYXK（湘）2015-0017]提供。大鼠分笼饲养（每笼5只），按照啮齿类动物喂养的标准饲养，在通风良好、自然光照、温度保持在22℃左右、相对湿度为55%的动物房中饲养，自由进食水。动物实验方案得到了南华大学医学伦理委员会批准。

1.3 实验分组和衰老大鼠模型建立

大鼠购买后适应性喂养1周，通过Morris水迷宫实验检测大鼠的空间记忆能力。具有基本一致的记忆能力的大鼠被选用，通过随机数字表法将大鼠分为对照组、衰老模型组和衰老训练组，每组12只。衰老模型组大鼠腹腔注射D-半乳糖[150 mg/（kg·d）]，共12周。衰老训练组大鼠腹腔注射D-半乳糖[150 mg/（kg·d）]，同时每天进行有氧游泳训练60 min，共12周。D-半乳糖用生理盐水溶解，注射体积为0.5 mL/100 g体重，对照组大鼠给予等量的生理盐水每天腹腔注射。12周有氧游泳运动训练结束后，再通过随机数字表法将每组大鼠分为2个小组，其中一组的大鼠进行Morris水迷宫实验，实验时间为6 d;而另一组大鼠进行自然喂养6 d，用于Western blot检测（n = 6）。

1.4 有氧游泳运动训练

衰老训练组大鼠在3 d的适应性游泳运动后进行游泳训练。游泳训练的圆形水池规格为150 cm×70 cm，水深50 cm，水温维持在35℃左右。大鼠每天游泳训练的时间为60 min，共12周。每个游泳池同时5只大鼠进行训练。

1.5 Morris水迷宫检测

全部的游泳训练结束后，所有大鼠的空间记忆能力均采用Morris水迷宫实验检测。大鼠依次进行定位航行实验和空间探索实验。每天上午进行定位航行实验，实验时间为5 d，将大鼠面向游泳池壁，每次都从事先标记的入水点将大鼠依次放入水中，然后记录逃避潜伏期，即大鼠在2 min内寻找到实验平台并爬上平台在平台上停留10 s以上所需要的时间。同时记录所有大鼠从被放入水中开始到爬上平台的总游泳距离。定位航行实验结束后的第2天上午开始空间探索实验检测，首先撤去游泳池中的实验平台，每次固定从第3象限将大鼠放入水中，然后记录大鼠在2 min内穿越原实验平台区域的次数和穿越原实验平台区域的时间[10]。

1.6 Western blot

在Morris水迷宫检测试验结束完毕后，采用脱颈椎的方法将大鼠处死。将大鼠的颅骨打开，剥取整个脑组织，然后再将海马组织小心地剥取出来，用磷酸盐缓冲液将血液等清洗干净。取适量海马组织，提取组织总蛋白，按試剂盒说明进行操作。测定样本总蛋白的浓度，取50 μg总蛋白样本在上样缓冲液中煮沸，使蛋白充分变性。取10 μL总蛋白样品，通过SDS-聚丙酰胺凝胶电泳将蛋白分离开来。通过转膜仪将蛋白质转移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，4%脱脂牛奶封闭PVDF膜2 h。加入兔抗大鼠ASIC1a（1∶150）、ASIC1b（1∶200）、ASIC2a（1∶200）、ASIC2b（1∶300）、ASIC3（1∶150）、ASIC4（1∶400）和β-actin（1∶1000）的一抗，4℃条件下孵育过夜。磷酸盐缓冲液洗膜3次，再加入二抗，4℃条件下继续孵育4 h。电化学发光（electro-chemi-luminescence，ECL）试剂显影在胶片上，凝胶图像分析系统对胶片扫描并记录结果。采用Image J软件进行结果分析，采用目的蛋白与内参β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件对实验结果进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用重复测量资料方差分析处理Morris水迷宫测试中逃避潜伏期和到达平台游过的距离，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验大鼠的一般情况

对照组大鼠反应机警，活动自如，神态安详，进食和饮水均正常，体毛光亮;衰老模型组大鼠精神萎靡，活动迟缓，反应迟钝，体毛稀疏、干枯、没有光泽，但肢体活动正常;衰老训练组大鼠精神状况明显好转，活动较自如，反应稍微迟钝。

2.2 有氧游泳运动对衰老大鼠的学习和记忆能力的影响

游泳训练完毕后，通过Morris水迷宫测试检测大鼠的学习和记忆能力。随着水迷宫测试天数的增加，各组大鼠的逃避潜伏期和到达实验平台游过的总距离均显著缩短（P < 0.05）。在定位航行实验中，与对照组比较，在实验的第2、3、4、5天，衰老模型组大鼠的逃避潜伏期和到达实验平台游过的总距离均显著增加（P < 0.05）;而衰老训练组大鼠的逃避潜伏期和到达实验平台游过的总距离均较衰老模型组显著缩短（P < 0.05），见表1～2。在空间探索实验中，衰老模型组大鼠穿越原实验平台区域的次数和穿越原实验平台区域的时间均较对照组显著减少（P < 0.05）;衰老训练组大鼠穿越原实验平台区域的次数和穿越原实验平台区域的时间均较衰老模型组显著增加（P < 0.05），见表3。

2.3 有氧游泳运动对衰老大鼠的海马组织中ASICs各亚型表达的影响

衰老模型组大鼠的海马组织中ASIC1a和ASIC1b的蛋白表达与对照组比较均显著增加（P < 0.05），而ASIC4的蛋白表达显著降低（P < 0.05）;衰老训练组大鼠的海马组织中ASIC1a和ASIC1b蛋白表达与衰老模型组比较均显著降低（P < 0.05），而ASIC4的蛋白表达显著增加（P < 0.05）。各组间ASIC2a、ASIC2b和ASIC3的蛋白表达比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

3 讨论

衰老是指人体在生长发育完全成熟后，随着年龄逐渐增加，机体的生理功能逐渐减退，出现一系列全身性的、多方面的退行性变化，如皮肤松弛和骨质疏松等，与衰老关系密切的疾病如阿尔茨海默病、糖尿病、高血压和动脉硬化等发病概率增加[11-12]。因此阐明引发衰老的原因和机制，以寻求延缓衰老的策略和途径，对提高老年人的生命质量具有十分重要的现实意义。随着机体的衰老，器官和组织的功能逐渐退化减弱，而学习和记忆能力的减退是衡量衰老发生的一个很重要的指标。大脑边缘系统在信息处理方面发挥着十分重要的作用，海马是边缘系统的重要成员，是与学习和记忆关系最密切的脑区，又是最容易受衰老影响的脑区[13-15]。

D-半乳糖被细胞摄取后，在细胞内被醛糖还原酶催化而产生半乳糖醇，而半乳糖醇不能被细胞代谢降解而堆积在细胞中，增加细胞内的渗透压，使细胞吸水肿胀，导致细胞功能障碍和细胞内代谢紊乱，诱发衰老的发生，因此D-半乳糖是诱导亚急性衰老动物模型的常用试剂[16-17]。本研究中给大鼠腹腔注射D-半乳糖12周后大鼠出现精神萎靡，活动迟缓，体重减轻，反应迟钝，体毛稀疏、干枯、没有光泽等衰老的表现。Morris水迷宫实验结果显示，在定位航行实验的第2、3、4、5天，衰老大鼠的逃避潜伏期和到达实验平台游过的总距离较对照组均明显增加。在空间探索实验中，衰老大鼠穿越原实验平台区域的次数和穿越原实验平台区域的时间均明显缩短。这些结果提示衰老大鼠的模型成功建立。

大量的研究表明合理运动可改善学习和记忆功能，延缓衰老的发展进程[18-20]。本研究结果显示衰老训练组大鼠精神状况明显好转，活动自如，毛发光亮，空间学习和记忆能力也明显改善，表现为在定位航行实验的第2、3、4、5天，與衰老模型组比较，衰老训练组大鼠的逃避潜伏期和到达平台游过的距离均显著减小。在空间探索实验中，衰老训练组大鼠穿越原实验平台区域的次数和穿越原实验平台区域的时间明显增加。

ASICs在脊髓、丘脑、小脑、脑桥、前脑、中脑和脑干等部位均有广泛表达，在中枢神经系统中主要表达在神经细胞上，在星型胶质细胞和小胶质细胞上也有表达，而其他神经胶质细胞如少突胶质细胞等目前还没有发现有表达[21]。ASICs是属于配体门控型离子通道，是退化蛋白/上皮钠通道超家族成员。ASICs存在细胞膜上可直接感受机体内环境中pH值的变化，调控离子通道的开放与关闭，介导Na+和Ca2+的内流，使细胞膜产生去极化，引发兴奋性效应。在中枢神经系统中主要有ASIC1a、ASIC1b、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4这6种亚型的表达[22]。研究表明学习和记忆能力的改变与ASIC表达的变化有关，ASIC参与了学习和记忆的机制。王杰等[23]研究发现油脂可提高大鼠空间学习和记忆能力，其机制可能与影响大鼠海马中ASIC1a、ASIC1b和ASIC4 mRNA的表达水平有关。因此本研究中采用Western blot检测大鼠海马中ASIC蛋白的水平，结果显示衰老模型组大鼠海马中ASIC1a和ASIC1b的蛋白表达均显著增加，而ASIC4的蛋白表达显著降低（P < 0.05）。衰老训练组大鼠海马组织ASIC1a和ASIC1b蛋白表达与衰老模型组比较均显著降低，而ASIC4的蛋白表达显著增加。这些结果提示有氧游泳运动可以逆转衰老过程中ASIC蛋白表达的变化，这可能是有氧游泳运动能改善衰大鼠的空间学习和记忆能力降低的机制之一。

总之，本研究结果阐明有氧游泳运动可改善衰老大鼠的学习和记忆能力，而其机制可能与降低海马组织中ASIC1a和ASIC1b表达而增加ASIC4的表达有关。

[参考文献]

[1]  Voss MW，Clark R，Freedberg M，et al. Striking a chord with healthy aging：memory system cooperation is related to preserved configural response learning in older adults [J]. Neurobiol Aging，2018，63：44-53.

[2]  Li J，Zhang CX，Liu YM，et al. A comparative study of anti-aging properties and mechanism：resveratrol and caloric restriction [J]. Oncotarget，2017，8（39）：65717-65729.

[3]  Yan LJ，Yang HT，Duan HY，et al. Analysis on the relationship and mechanism of high blood pressure and vascular aging on the condition that the gender and age matches [J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（3 Suppl）：84-87.

[4]  龚晓明，郑澜，瞿树林，等.有氧运动对中老年大鼠骨髓内皮祖细胞增殖能力的影响[J].成都体育学院学报，2014， 40（10）：60-63.

[5]  Rzechorzek W，Zhang H，Buckley BK，et al. Aerobic exercise prevents rarefaction of pial collaterals and increased stroke severity that occur with aging [J]. J Cereb Blood Flow Metab，2017，37（11）：3544-3555.

[6]  王小艳.有氧运动对大鼠动脉粥样硬化发展过程中血浆的影响[J].成都体育学院学报，2014，40（12）：91-94.

[7]  Ye S，Yang R，Xiong Q，et al. Acute stress enhances learning and memory by activating acid-sensing ion channels in rats [J]. Biochem Biophys Res Commun，2018，498（4）：1078-1084.

[8]  Mango D，Braksator E，Battaglia G，et al. Acid-sensing ion channel 1a is required for mGlu receptor dependent long-term depression in the hippocampus [J]. Pharmacol Res，2017，119：12-19.

[9]  Wu PY，Huang YY，Chen CC，et al. Acid-sensing ion channel-1a is not required for normal hippocampal LTP and spatial memory [J]. J Neurosci，2013，33（5）：1828-1832.

[10]  张倩璐，李祥，王波，等.二氢杨梅素对丙泊酚麻醉引起的大鼠认知功能障碍的影响及机制[J].中南医学科学杂志，2019，47（1）：7-11.

[11]  朱华，于品，徐艳峰，等.自然衰老过程中SD大鼠免疫系统结构功能的变化[J].中国实验动物学报，2018，26（1）：95-100.

[12]  Boskey AL，Imbert L. Bone quality changes associated with aging and disease：a review [J]. Ann N Y Acad Sci，2017，1410（1）：93-106.

[13]  Jin C，Gao L，Li Y，et al. Lanthanum damages learning and memory and suppresses astrocyte-neuron lactate shuttle in rat hippocampus [J]. Exp Brain Res，2017，235（12）：3817-3832.

[14]  仲丽丽，张维嘉，刘旭，等.天草醇提物对阿尔茨海默病小鼠行为学及海马炎症介质的影响[J].中国医药导报，2017，14（34）：70-72.

[15]  董云芳，冯慧利，陈芳，等.金思维对东莨菪碱致记忆障碍小鼠脑胆碱能系统的影响[J].中国实验动物学报，2018，26（1）：107-113.

[16]  Song TY，Lin HC，Chen CL，et al. Ergothioneine and melatonin attenuate oxidative stress and protect against learning and memory deficits in C57BL/6J mice treated with D-galactose [J]. Free Radic Res，2014，48（9）：1049-1060.

[17]  李慧孫，乐栋.红景天苷抗衰老和抗氧化药理机制研究新进展[J].中国医药导报，2018，15（7）：51-54，81.

[18]  林雪灵，李雪，邓文骞，等.不同时期有氧运动对大鼠脑衰老和额叶NCAM表达的影响[J].成都体育学院学报，2014，40（6）：63-67.

[19]  李健兵，杨建全.长期有氧运动联合桂枝茯苓胶囊治疗高血压颈动脉粥样硬化的临床效果[J].中国医药导报，2018，15（17）：40-43.

[20]  王莉智，和荣丽，杨桂姣，等.自主跑轮运动对阿尔茨海默病模型小鼠学习记忆能力和海马内炎性细胞因子表达的影响[J].中国运动医学杂志，2017，36（4）：328-332.

[21]  Friese MA，Craner MJ，Etzensperger R，et al. Acid-sensing ion channel-1 contributes to axonal degeneration in autoimmune inflammation of the central nervous system [J]. Nat Med，2007，13（12）：1483-1489.

[22]  Gonzales EB，Sumien N. Acidity and Acid-Sensing Ion Channels in the Normal and Alzheimer's Disease Brain [J]. J Alzheimers Dis，2017，57（4）：1137-1144.

[23]  王杰，王丽梅，赵秀举，等.不同油脂对大鼠空间学习记忆的影响及与ASICs亚型受体的关系[J].中国油脂，2015，40（2）：40-45.