邓君健　张帆　包文庭　熊琳　刘远识　 范黎　徐细明

[摘要] 目的 研究Twist對结直肠癌SW480细胞的上皮-间质转化（EMT）、肿瘤干细胞表型及化疗抵抗能力的影响。 方法 收集2012年1～12月武汉大学人民医院结直肠癌患者临床样本共30例，分析Twist在结直肠癌组织及其癌旁组织中的表达差异;通过过表达手段，检测Twist对SW480细胞的EMT表型转换调控情况;分析Twist对SW480细胞的成球能力、干细胞标志物表达、化疗抵抗的影响。 结果 Twist在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P < 0.05）。体外实验证实Twist可促使SW480细胞EMT表型转换，表现为Twist促使SW480细胞形态变化及上调间质相关的N-钙黏蛋白表达，而显著抑制上皮相关的E-钙黏蛋白表达（P < 0.05）。Twist上调SW480细胞的成球能力及肿瘤干细胞标志物Bmi-1、Nanog、CD44的表达（P < 0.05）;Twist可通过ABCB1/P-gp途径使SW480细胞获得化疗药物抵抗能力。 结论 Twist可促使结直肠癌SW480细胞发生EMT、获得干细胞特性及耐药能力，Twist可作为潜在的结直肠癌化疗抵抗治疗靶点。

[关键词] 结直肠癌;Twist;上皮-间质转化;肿瘤干细胞;化疗抵抗

[中图分类号] R735.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）06（c）-0004-06

Effect and mechanism of twist promoting stem cell ability obtaining and chemotherapy resistance of colorectal cancer SW480 cells by EMT

DENG Junjian1   ZHANG Fan2   BAO Wenting1   XIONG Lin1   LIU Yuanshi1   FAN Li1   XU Ximing1

1.Tumor Center， Renmin Hospital， Wuhan University， Hubei Province， Wuhan   430060， China; 2.Department of Pharmacy， Renmin Hospital， Wuhan University， Hubei Province， Wuhan   430060， China

[Abstract] Objective To study the effect of Twist on epithelial-mesenchymal transition （EMT）， cancer stem cell phenotype and chemotherapy resistance of SW480 cells. Methods From January to December 2012， 30 colorectal cancer samples were collected in Renmin Hospital， Wuhan University. And the expression of Twist in colon cancer tissues and adjacent tissues were analyzed; the effect of Twist on SW480 cells EMT phenotype switching was detected through the over expression assay. The role of Twist in SW480 cells mammospheres number， cancer stem cell markers expression and chemotherapy resistance were investigated. Results The expression of Twist in colon cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues （P < 0.05）. Twist could promote EMT phenotype switching， evidenced by the changes in cell morphology， the up-regulation of interstitial-associated N-cadherin expression， and the significant inhibition of epithelial-associated E-cadherin expression （P < 0.05）. Twist increased mammospheres number and the expression of cancer stem cell markers SW480 cells， such as Bmi-1， Nanog， CD44 in （P < 0.05）. Twist could promote SW480 cells to obtain chemotherapy resistance ability through ABCB1/P-gp pathway. Conclusion Twist could promote SW480 cells EMT phenotype switching， stem cell characteristics and chemotherapy resistance ability obtaining， indicating that Twist could serve as a potential target for chemotherapy resistance of colorectal cancer.

[Key words] Colorectal cancer; Twist; Epithelial-mesenchymal transition; Cancer stem cell; Chemotherapy resistant

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是癌细胞中部分胚胎基因重编程的病理过程，这一过程具有可逆的特点[1-2]。EMT行为导致的细胞表型转换被认为是多种癌细胞获得侵袭及远处转移能力的基础，其中包括了结直肠癌（colorectal cancer，CRC）细胞[3-4]。EMT行为的标志是上皮细胞间连接的溶解及细胞骨架的整体重组，这一变化是由基因的差异表达所决定的[5-6]。EMT发生时，众多基因表达重编程[7]。经典研究认为，EMT变化只增强细胞的侵袭能力，而最新研究提示，肿瘤细胞EMT转换，还有促使癌细胞获得放化疗抵抗、逃避衰老、干性获得、加速细胞分裂等能力的功能[8-9]。扭曲因子Twist，是一种具有碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix）结构域的转录因子，介导了胚胎的发育[10]。既往研究证实，Twist可调控肿瘤细胞的EMT行为[11]，然而其在结直肠癌细胞中更多的作用，目前尚不明确。本课题组前期研究发现，Twist在结直肠癌患者的病理样本中，相较于癌旁组织，其在癌组织中的表达显著上调。因此，本研究采用结直肠癌细胞系SW480作为研究工具，分析Twist对结直肠癌细胞多种生物学行为的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2012年1～12月武汉大学人民医院结直肠癌患者临床样本共30例，患者的纳入以临床手术后组织切片细胞学染色确诊结直肠癌为准，取远离癌组织的正常结直肠黏膜样本癌旁组织（距离癌组织5 cm以上）30例作为对照，且纳入患者均未接受过任何肿瘤相关治疗的初诊患者。本研究已通过武汉大学医学伦理委员会的审批，参与研究者均知情同意并签署知情同意书。

1.2  研究方法

1.2.1 主要仪器、试剂  本研究中的抗体相关信息如下：E-cadherin一抗购自美国Cell Signaling Technology公司，N-cadherin一抗、vimentin一抗、Twist一抗、P-gp一抗、α-tubulin一抗购自美国Santa Cruz Biotechnol公司。Bmi-1一抗、Nanog一抗购自美国Epitomics公司。Alexa Fluor 488/594标记的二抗、辣根过氧化物酶标记的二抗、DAPI染液及Lipofectamine 2000购自美国 Invitrogen公司。PrimeScript？誖一步法逆转录试剂盒RT及荧光定量PCR SYBR染液购自日本TAKARA公司。

1.2.2 组织及细胞RNA的提取  患者样本组织置于液氮中保存，提取RNA时，将组织置于将研钵液氮中碾成粉末状，加入Trizol，再以氯仿萃取，随后吸出上层水相，加入异丙醇沉淀RNA，混匀后4℃低温过夜。次日，差速离心并依次以75%、95%乙醇洗涤RNA，随后溶解RNA。细胞的RNA提取为：向细胞培养板中加入Trizol，反复吹打，吸取至EP管，后续操作同组织的酚氯仿法萃取。

1.2.3 cDNA合成  本研究中的cDNA合成，采用日本TAKARA公司的一步法逆转录cDNA合成试剂盒。每次反应体系为：RNA 1 μg，总体积20 μL反应程序为：37℃ 15 min，85℃ 5 s，降温至4℃。反应完成后，立即将样本置于-80℃冰箱低温保存，直至使用。

1.2.4 荧光定量PCR  本研究中采用TAKARA公司生产的荧光定量PCR mix buffer进行定量扩增反应，反应体系为20 μL，反应程序为：95℃预变性5 min，随后进行39个循环扩增，包括95℃ 1 min，57℃ 30 s，最后5 min溶解曲线。PCR的结果采用GAPDH校正，以校正值为统计值。引物信息见表1。

1.2.5 细胞培养及转染  SW480细胞购自上海中科院细胞典藏中心，培养条件：DMEM basic培养基，10%胎牛血清。孵箱设置为5% CO2，37℃。本研究中的过表达，采用脂质体包裹载体转染。實验前，将细胞种于6孔板中，细胞数量为2×105个，次日将培养基换为无血清培养基，饥饿2 h后，以Lipofectamine 2000试剂包裹2 μg的空载体pcDNA3.1或是pcDNA3.1-Twist载体，转染至SW480细胞。转染6 h后，换为含10%胎牛血清的培养基，孵箱培养48 h后收取细胞。

1.2.6 细胞侵袭检测  细胞检测采用Boyden chambers，预先包被基质胶于小室内。将300 μL体积内的1×105个细胞（培养基胎牛血清浓度为1%）分别转染后种植于小室上层。随后将600 μL胎牛血清浓度为10%的培养基加至小室下的孔板内，作为趋化剂。细胞种植48 h后，终止培养，4%的多聚甲醛固定30 min，随后结晶紫染色，拍照分析。

1.2.7 Western blot分析  细胞以预冷的PBS洗涤后，加入RIPA裂解液裂解并置于冰上超声破碎，再次冰上裂解30 min。12 000 r/min 4℃低温离心15 min后吸取上清，测定浓度后，加入蛋白loading buffer 100℃煮至蛋白变性，至于-80℃冰箱低温保存，直至使用。以Bio-rad公司的蛋白电泳系统检测各组各蛋白表达差异情况，以SDS-PAGE胶进行蛋白电泳，随后将蛋白转运至聚偏二氟乙烯膜，以5%的脱脂牛奶室温下封闭2 h，加入一抗工作液过夜（浓度为1∶1000）。次日，室温下复温1 h，随后以TBST洗脱，加入辣根过氧化物酶标记的二抗工作液进行孵育，依次洗涤，曝光，获得图像并分析。

1.2.8 细胞活力测定  细胞活力的测定采用噻唑蓝比色法（MTT）试剂盒，以细胞密度为1×104种植于96孔板中后，分别进行转染，并按浓度梯度加入奥沙利铂（孵育24 h后，PBS洗涤细胞，加入MTT试剂，于570 nm波长处检测各组细胞活力差异情况。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism Software Version 5.0软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间的比较采用One-way ANOVA分析，兩组间比较采用非配对t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 扭曲基因Twist在结直肠癌组织中表达显著高于癌旁组织

为初步探索Twist在结直肠癌中的作用，本研究首先通过荧光定量PCR检测了Twist在结直肠癌组织和癌旁组织中的转录本存在差异情况。结果发现，扭曲基因Twist在结直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织，差异有统计学意义（P < 0.05），见图1。提示在结直肠癌细胞中可能发挥癌基因的作用。

2.2 过表达Twist促使SW480细胞发生EMT形态变化

将Twist在SW480细胞进行过表达后，SW480细胞形态发生了急剧变化，由圆形向长梭形态分化，提示可能发生了EMT能力的变化。细胞侵袭能力检测发现，Twist可显著上调SW480的侵袭能力，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2。

2.3 Twist可显著上调EMT分子表达

荧光定量PCR及Western blot检测EMT相关分子表达发现：Twist可显著上调间质相关的N-钙黏蛋白表达，显著抑制上皮相关的E-钙黏蛋白表达，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图3。

2.4 Twist可促使SW480细胞获得部分干细胞特性

过表达Twist后，调SW480细胞成球能力显著上调，差异有统计学意义（P < 0.05），且干性分子Bmi-1、Nanog、CD44的表达上调，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图4。

2.5 Twist可上调SW480细胞化疗药物抵抗的能力

SW480细胞暴露于梯度浓度的奥沙利铂（Oxaliplatin）后，联合进行Twist过表达，随后通过MMT试剂盒检测各组细胞的活力差异情况，结果发现，Twist可保护奥沙利铂对SW480细胞的杀伤。进一步，本研究检测了肿瘤化疗抵抗分子ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCC3、ABCC4、ABCC5、ABCG2、ERCC1、XRCC1、MSH2、TUBB3、POLH、GSTπ及γ-GT1的表达变化情况，结果提示Twist可显著上调ABCB1的表达，而对其他分子的表达变化并无明显影响。进一步检测发现，Twist可显著上调ABCB1编码的P-gp蛋白表达，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图5。

3 讨论

结直肠癌是临床常见的肿瘤之一，具有发病率、死亡率高的特点，其发病率位居世界第三，死亡率为世界第四[12-14]。结直肠癌的好发中位年龄为70岁，且随着年纪增长，患病率依次升高[13-14]。既往相关研究取得了长足进展，然而其机制仍然不明确。当前关于结直肠癌的治疗措施主要集中于传统手术切除及放化疗，术后复发及放化疗抵抗等远期不良预后因素依旧较为常见[15]，肿瘤细胞放化疗抵抗是患者不良预后产生的主要原因[16-17]。

肿瘤放化疗打击后的异质细胞产生及肿瘤干性获得的过程中，肿瘤细胞的转录组重编程，众多基因簇表达失衡[18]。本研究发现扭曲基因Twist在癌组织中表达上调，扭曲基因Twist是胚胎发育的关键分子，提示其可能作为癌基因发挥作用，为明确其是否也在放化疗抵抗中发挥作用，本研究首先在结直肠癌SW480细胞系中进行过表达，发现Twist可促使SW480细胞往侵袭表型转换，表现为细胞形态变为梭型，侵袭能力增强，EMT相关标志物急剧变化。研究表明，肿瘤细胞往肿瘤干细胞转变时，其转录组重编程，而EMT相关的转录因子snail、Twist可驱动相关基因表达，促使其干性获得[19-20]。本研究发现Twist在肿瘤组织高表达，同时Twist可促使EMT转变，snail是EMT的关键分子，那么，Twist是否可以促使SW480细胞往干细胞分化，从而获得抗打击能力呢？为此，本研究检测了Twist对SW480细胞成球能力的影响，细胞聚聚成球是干细胞的一大特性，研究发现，Twist可促使SW480细胞成球并可以上调干细胞标志物Bmi-1、Nanog、CD44的表达。进一步，本研究对SW480细胞进行了奥沙利铂打击，由结果可知，随着奥沙利铂浓度增加，对照细胞的活性急剧下调，而Twist可保护大部分SW480细胞存活，提示获得干性的SW480细胞对化疗药物的打击失去了敏感性。随后研究发现，该作用是通过ABCB1/P-gp实现的。P-gp是能量依赖性“药泵”调节分子，通过消耗ATP将肿瘤细胞内的化疗药物逆浓度泵至细胞外，降低肿瘤细胞内化疗药物浓度从而产生耐药性[21-22]。

综上所述，Twist可促使结直肠癌SW480细胞发生EMT表型转换，获得干细胞特性，进一步通过ABCB1/P-gp途径，增强其自身耐药。本研究揭示了新的结直肠癌化疗抵抗作用机制，提供了潜在的治疗靶点。

[参考文献]

[1]  Christofori G. New signals from the invasive front [J]. Nature，2006，441（7092）：444-450.

[2]  Thiery JP，Acloque H，Huang RY，et al. Epithelialmesenchymal transitions in development and disease [J]. Cell，2009， 139（5）：871-890.

[3]  Kalluri R， Weinberg RA. The basics of epithelial-mesenchymal transition [J]. J Clin Invest，2009，119（6）：1420-1428.

[4]  Wu Y， Zhou BP. Snail：More than EMT [J]. Cell Adh Migr，2010，4（2）：199-203.

[5]  Campbell K. Contribution of epithelial-mesenchymal transitions to organogenesis and cancer metastasis [J]. Curr Opin Cell Biol，2018，55：30-35.

[6]  Diepenbruck M，Christofori G. Epithelial-mesenchymal transition （EMT） and metastasis：yes，no，maybe？ [J]. Curr Opin Cell Biol，2016，43：7-13.

[7]  Liu B，Miyake H，Nishikawa M，et al. Expression profile of epithelial-mesenchymal transition markers in non-muscle-invasive urothelial carcinoma of the bladder：correlation with intravesical recurrence following transurethral resection [J]. Urol Oncol，2015，33（3）：110.

[8]  Sui H，Zhu L，Deng W，et al. Epithelial-mesenchymal transition and drug resistance：role，molecular mechanisms，and therapeutic strategies [J]. Oncol Res Treat，2014，37（10）：584-589.

[9]  Huang J，Li H，Ren G. Epithelial-mesenchymal transition and drug resistance in breast cancer （Review）[J]. Int J Oncol，2015，47（3）：840-848.

[10]  Dong CY，Liu XY，Wang N，et al. Twist-1，a novel regulator of hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid lineage development [J]. Stem Cells，2014，32（12）：3173-3182.

[11]  Pirinen E，Soini Y. A survey of zeb1，twist and claudin 1 and 4 expression during placental development and disease [J]. APMIS，2014，122（6）：530-538.

[12]  Brenner H，Kloor M，Pox CP. Colorectal cancer [J]. Lancet，2014，383：1490-502.

[13]  Siegel R，DeSantis C，Virgo K，et al. Cancer treatment and survivorship statistics [J]. CA Cancer J Clin，2012， 62（4）：220-241.

[14]  Center MM，Jemal A，Smith RA，et al. Worldwide variations in colorectal cancer [J]. CA Cancer J Clin，2009，59（6）：366-378.

[15]  Roncucci L，Mariani F. Prevention of colorectal cancer：How many tools do we have in our basket？ [J]. Eur J Intern Med，2015，26（10）：752-756.

[16]  Goodwin Jinesh G，Willis DL，Kamat AM. Bladder cancer stem cells：biological and therapeutic perspectives[J]. Curr Stem Cell Res Ther，2014，9（2）：89-101.

[17]  Islam F，Gopalan V，Wahab R，et al. Cancer stem cells in oesophageal squamous cell carcinoma：Identification，prognostic and treatment perspectives [J]. Crit Rev Oncol Hematol，2015，6（1）：9-19.

[18]  Friedmann-Morvinski D，Verma IM. Dedifferentiation and reprogramming：origins of cancer stem cells [J]. EMBO Rep，2014，15（3）：244-253.

[19]  Mladinich M，Ruan D，Chan CH. Tackling cancer stem cells via inhibition of EMT transcription factors [J]. Stem Cells Int，2016，2016：5285892.

[20]  Nuti SV，Mor G，Li PR，et al. TWIST and ovarian cancer stem cells：implications for chemoresistance and metastasis [J]. Oncotarget，2014，5（17）：7260-7271.

[21]  Hano M，Tomá？觢ová L，？譒ere？觢 M，et al. Interplay between P-Glycoprotein Expression and Resistance to Endoplasmic Reticulum Stressors [J]. Molecules，2018，23（2）.pii：E337. doi：10.3390/molecules23020337.

[22]  Joshi P，Vishwakarma RA，Bharate SB. Natural alkaloids as P-gp inhibitors for multidrug resistance reversal in cancer [J]. Eur J Med Chem，2017，138：273-292.