韩 涛，杨雪妮，张 芳

（1.福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002；2.福建中医药大学药学院，福建 福州 350108）

霉菌是丝状真菌的统称，广泛分布于土壤、水、空气等自然环境中[1-3]，因此食品极易被霉菌污染。食品中污染的霉菌不仅能破坏其基质的结构，造成食物的营养损耗以及每年达数十亿元的经济损失[4]；而且通过代谢会产生有害毒素[5-11]，从而造成健康危害[12-18]，因此，是否污染霉菌是评判食品品质的重要指标之一。近年来，世界各国纷纷制订食品中霉菌的各种限量标准，同时加强霉菌检测技术的研究。

我国先后5 次修订了食品中霉菌计数的方法标准[19-23]，据此我国各级监督检测机构全面开展食品中霉菌的检测工作，但是检测中霉菌培养物被污染的现象频发，这主要是因为每个疏松干燥绒毛状的霉菌菌落可产生数量巨大的孢子，同时霉菌的孢子具有小、轻、干、多、休眠期长和抗逆性强等特点，任何一个孢子在适宜条件下都能发展成新的个体。常规霉菌检测的培养过程中、以及观察霉菌菌落时培养皿的移动过程中，不可避免地造成空气流动，霉菌孢子可趁机飘散进入空气中并随处散播、繁殖，引起严重的交叉污染和外部侵染，对霉菌检测的质量控制形成严峻的考验。而目前这一常见且棘手的问题始终困扰着相关人员，且无有效的控制措施。

生物体的封闭式培养是指将目标培养物利用特定的设施隔离于相对独立的微环境中，以进行培养的一种技术，因其具有良好的温度和湿度控制、污染防护等优点，而在植物的无土槽培、单细胞藻类的快速培养等领域得到广泛应用[24-25]。如果将封闭式培养方法应用于霉菌的检测，特定的隔离设施可以将目标培养物隔离以形成霉菌生长的相对独立的微环境，进而有效杜绝霉菌孢子的扩散污染，但是封闭式培养的微环境中氧气含量是不可忽视的问题，因为培养过程中充足的氧气供给是霉菌正常生长发育的基础，在通风良好的培养环境中，空气中的氧气（体积分数21%）可满足霉菌的需求，但是如果培养环境氧气体积分数太低，霉菌将停止生长。目前国内外鲜见将封闭式培养方法应用于霉菌检测的相关报道。

本实验通过微氧胁迫下黑曲霉的生长动态研究，构建霉菌的封闭式培养方法以防止霉菌孢子的扩散和污染，进一步依托食品中霉菌的检测分析，比对封闭式培养方法与常规敞开式培养方法的计数结果，探讨霉菌检测过程中封闭式培养方法的可行性和实用性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑曲霉（Aspergillus nige，菌株编号：ATCC 16404）购于美国模式培养物集存库。38 个不同厂家和批号的食品样品购自福建省福州市几个不同的超市，包括5 种玉米淀粉、4 种马铃薯淀粉、1 种小麦淀粉、8 种紫菜、6 种海苔、5 种桂圆干、2 种红枣干、1 种枸杞、2 种纸皮核桃、1 种开心果、3 种白晒花生，编号依次为SP1～SP38。

沙氏液体培养基（批号3105358） 广东环凯微生物科技有限公司；孟加拉红琼脂培养基（批号170316）北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

HVE-50高压灭菌器 日本Hirayamaha公司；微量可调移液器 德国Eppendorf公司；Hfsafe1200生物安全柜 中国上海力申公司；SPX-250B生化培养箱中国上海悦丰仪器仪表有限责任公司；BSA224S分析天平德国赛多利斯集团；DHG-9240A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；ZQTY-70振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司；Bagmixer 400拍击式均质器 法国Interscience公司；ADKS-1便携式氧气检测仪 艾特思电子科技有限公司；CVK-UB2超低温冰箱 日本Sanyo公司；AP-9925抽滤设备 加拿大Autoscience公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及菌悬液制备

取冷冻保存的黑曲霉标准菌株，接种至无菌沙氏液体培养基中，于200 r/min、28 ℃振荡培养5 d，再次转接至沙氏液体培养基活化2 次，之后取菌丝球接种于孟加拉红培养基平皿，28 ℃培养7 d至孢子大量产生后注入适量无菌生理盐水，用无菌涂布棒轻轻刮取，使黑曲霉游离于生理盐水中，再用400 目无菌纱布过滤去除营养菌丝体，收集孢子悬液用血球计数板计数[26]，根据计数结果（未给出）用无菌生理盐水适当稀释孢子悬液，以此获得菌悬液备用（菌悬液经后续实验测得霉菌菌落数约为2 000 CFU/mL）。

1.3.2 黑曲霉的增殖测试

取1.3.1节制备的菌悬液10 mL至1 300 mL无菌沙氏液体培养基，用拍击式均质器均质2 min后分装于13 个梯度（每梯度均设置实验组和对照组，两组各设置2 个平行）的离心管中（编号分别为1～13），培养基分装量分别为56、50、40、30、21、18、17、16、15、14、12、10、5 mL，离心管容积为57 mL，此时13 个梯度的离心管中空气与培养基体积比分别为0.02∶1、0.14∶1、0.43∶1、0.90∶1、1.71∶1、2.17∶1、2.35∶1、2.56∶1、2.80∶1、3.07∶1、3.75∶1、4.70∶1、10.40∶1。分装完毕后，旋紧离心管盖（使离心管处于密封状态），之后转移至振荡培养箱中于200 r/min、28 ℃培养5 d。培养过程中对照组定期做透气处理（每3 h，于生物安全柜中，将对照组的离心管盖旋开静置5 min后旋紧，继续于200 r/min、28 ℃培养）。实验组不做透气处理。

培养结束后将离心管内所有培养物全部抽滤至微孔滤膜（滤膜孔径为0.45 μm，且事先60 ℃干燥3 h，并称量质量），再用一片微孔滤膜将培养物覆盖，并用等体积的无菌超纯水冲洗3 次，再次60 ℃干燥3 h后称量质量，获得不同离心管黑曲霉增殖的净质量。

1.3.3 黑曲霉的氧气消耗性实验

配制150 mL孟加拉红培养基于容积为600 mL的均质罐内（均质罐为圆柱形，底面直径为10 cm），共制备18 个梯度，分别编号为1～18，每个梯度2 个平行，包扎后高压蒸汽灭菌，待培养基冷却凝固后备用。梯度1～9为实验组，分别向均质罐注入1 mL菌悬液（1.3.1节制得），梯度10～18为对照组，不加菌悬液，之后用乳胶膜密封均质罐口，实验组和对照组于28 ℃培养箱中分别培养0、1、2、3、4、5、7、10、15 d。培养结束后于水下收集均质灌内气体，并用便携式氧气检测仪测定其氧气体积分数。

1.3.4 黑曲霉的封闭式培养与敞开式培养的比对测试

将1.3.1节制备的菌悬液采用GB 4789.15—2016《食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》[23]的方法进行霉菌计数，共进行15 个重复，每个重复同时进行2 组独立的测试，培养时一组采用GB 4789.15—2016[23]中明示的培养方法（即敞开式培养），另一组采用封闭式培养（取1 个无菌空培养皿和1 个凝固的孟加拉红培养基堆叠放置，共同转移至1 个无定形自封袋中，排除多余空气并封口，置于28 ℃恒温培养箱内培养。此时空气与培养基的体积之比约为3∶1，自封袋将目标培养皿隔离形成霉菌生长的相对独立的微环境，可防止霉菌孢子逃逸至自封袋外部，从而杜绝霉菌孢子的扩散污染）。培养5 d后计数平皿的霉菌菌落数。

1.3.5 紫菜中霉菌的重复性测试

对编号为SP14的紫菜样品进行霉菌计数，共进行9 个重复（编号1～9），每个重复同时进行2 组独立的测试，且2 组测试在培养时按照1.3.4节的方法分别采用敞开式培养与封闭式培养，培养5 d后计数平皿的霉菌菌落数。

1.3.6 食品中霉菌的比对测试

38 个不同的食品样品（编号依次为SP1～SP38）按照1.3.4节的方法分2 组分别采用敞开式培养与封闭式培养进行霉菌计数。

1.4 数据分析

食品中霉菌分布不均匀，且消长规律不定，因此在重复测试中数据的差异较大，而常规的再现性标准差以及不确定度评估等方法不适用于霉菌计数结果的比对分析。鉴于实际需要，业内普遍参考标准[27]中r（重复性相关系数）和R（复现性相关系数）两个参数进行比较评价，本实验也将R（R=｜lgX－lgY︱）用于分析霉菌敞开式培养和封闭式培养的计数结果的差异。进一步采用SPSS 18.0[28]对两种培养方法的计数结果进行配对t-检验（检验水准α=0.05）。同时，用OriginPro 8.0绘图软件绘制霉菌增殖曲线和氧气消耗曲线。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉的增殖测试结果

按照1.3.2节中13 个梯度的测试经过培养、抽滤、干燥、称质量等步骤后，以空气与培养基体积比为横坐标，以霉菌增殖净质量与培养基体积比（单位为mg/mL）为纵坐标，绘制黑曲霉增殖曲线（图1）。实验组的曲线在梯度9（培养基体积15 mL，空气体积42 mL，空气与培养基的体积比为2.8∶1）处出现明显的拐点，此处霉菌生长发生显著变化。在梯度8～1变化中，离心管中培养基的体积逐渐增多（16～56 mL），而实验组离心管内的空气体积下降迅速（41～1 mL），且吻合了黑曲霉增殖净质量与培养基体积的比值的下降规律，同时对照组的曲线起伏变化不大，而实验组和对照组的差异仅源自培养过程中氧气的供给量，因此氧气是制约实验组黑曲霉生长增殖的瓶颈，实验组离心管中空气体积的降低是黑曲霉增殖量的下降的主要原因。随着空气与培养基的体积比值的增大，在体积比达到2.8∶1时，实验组离心管中氧气含量可满足黑曲霉生长的需求，氧气的限制作用被解除，因此实验组和对照组梯度9～13黑曲霉的增殖曲线无明显变化。

所以，对于黑曲霉的封闭式培养，在空气与培养基的体积比大于2.8∶1的情况下，当培养至第5天时，黑曲霉的生长不受培养微环境中初始空气体积的限制。

图1 黑曲霉的增殖曲线Fig. 1 Growth curve of A. niger

2.2 黑曲霉的氧气消耗性实验

图2 黑曲霉的氧气消耗曲线Fig. 2 Oxygen consumption curve of A. niger

在1.3.3节实验中，考察黑曲霉在空气与培养基的体积比为3∶1的条件下，不同培养时间对氧气的消耗情况。经过接种、培养、测定氧气体积分数等步骤后，以培养时间为横坐标，以培养结束后均质罐内气体的氧气体积分数为纵坐标，绘制氧气消耗曲线（图2）。图2显示实验组（梯度1～9）在培养0～2 d，氧气消耗缓慢（氧气体积分数为20.5%左右），此时黑曲霉可能处于“调整期”，其细胞进行代谢调配以适应新的环境，为后期快速增殖做准备；之后，黑曲霉便进入了“对数期”，其细胞快速分裂增殖，同时消耗大量的氧气，造成了在培养3～7 d的时间内，氧气体积分数迅速下降（20.5%降至15.2%）；在培养7 d之后，黑曲霉细胞受各方面因素的影响而进入“稳定期”，代谢活动变慢，因此氧气体积分数下降较慢。而对照组（梯度10～18）的氧气体积分数维持不变（20.9%），说明培养微环境中氧气体积分数的变化仅源于黑曲霉细胞的代谢活动。

因此，对于黑曲霉的封闭式培养，在空气与培养基体积比为3∶1的条件下，当培养至第5天时，氧气消耗曲线（图2）未显示培养微环境中初始空气体积能显著影响黑曲霉的增殖。

2.3 黑曲霉封闭式培养与敞开式培养的比对

统计1.3.4节中1∶100稀释度的孟加拉红平皿的霉菌菌落数，并计算两个平行培养皿的平均值（Xi与Yi）和标准差（σXi与σYi）结果如表1所示。计算15 个重复的标准差（σXi与σYi）的差值（表1），其中2 个重复（编号5、14）的标准差相同，而5 个重复的σXi大于σYi，53%的重复的σXi小于σYi，因此σXi－σYi的值较均匀的分布于0的两侧，说明两种培养方法计数结果的精密度无明显差异。

根据1.4节计算敞开式培养与封闭式培养计数结果的复现性相关系数Ri（Ri=｜lgXi－lgYi︱），如表1所示，所有重复的复现性相关系数均小于0.25，满足标准[27]要求，说明敞开式培养和封闭式培养对于菌悬液中黑曲霉的计数结果无显著差异。

表1 黑曲霉敞开式培养与封闭式培养比对结果Table 1 Comparison between open culture and closed culture of A. niger

2.4 紫菜中霉菌的重复性

1.3.5 节进行的紫菜（样品SP14）中霉菌计数，结果如表2所示，其中显示了1∶100稀释度的样品稀释液的两个平行培养皿的平均值（Mj、Nj）和标准差（σMj、σNj），并分别计算了9 个重复的标准差的差值（σMjσNj），其中大于0的值有5 个（分别为3、5、6、7、8）、小于0的值为4 个。因此σMj－σNj值较均匀地分布于0的两侧，说明对于紫菜中霉菌的计数，敞开式培养与封闭式培养计数结果的精密度无明显差异。

计算敞开式培养与封闭式培养的复现性相关系数Rj’（Rj’=｜lgMj－lgNj︱）。表2显示9 次重复测试中复现性相关系数的最大值为0.220（编号8），均符合标准[27]关于复现性相关系数不大于0.45的要求，因此对于紫菜中霉菌的检测，敞开式培养和封闭式培养的计数结果无显著差异。

表2 紫菜中霉菌的敞开式培养与封闭式培养比对结果Table 2 Comparison between open culture and closed culture of mold in laver

2.5 食品中霉菌的比对测试结果

在38 个不同食品样品（1.3.6节）的霉菌计数结果中，22 个样品的孟加拉红平皿无菌落生长，因此不用于后续分析，其余16 个样品的菌落计数结果如表3所示，其中显示了不同稀释度样品稀释液的两个平行培养皿的平均值（Pk、Qk）和标准差（σPk、σQk）。16 个样品的σPk－σQk的值中，有6 个大于0（分别为SP3、SP4、SP7、SP11、SP33、SP37）、2 个等于0、8 个小于零，较均匀地分布于0的两侧，说明对于食品中霉菌的计数，敞开式培养与封闭式培养计数结果的精密度无明显差异。

之后计算敞开式培养与封闭式培养的复现性相关系数Rk”（Rk”=｜lgPk－lgQk︱）。16 个样品中复现性相关系数的最大值为0.138（样品SP25），因此16 个样品均符合标准[27]关于复现性相关系数不大于0.45的要求，所以对于食品中霉菌的检测，敞开式培养和封闭式培养的计数结果无显著差异。

表3 食品中霉菌的敞开式培养与封闭式培养比对结果Table 3 Comparison between open culture and closed culture of mold in food

2.6 敞开式培养与封闭式培养计数结果标准差的配对t-检验

采用1.4节统计分析方法分别对敞开式培养与封闭式培养计数结果的标准差（σXi与σYi、σMj与σNj、σPk与σQk）进行配对t-检验，以分析两种培养方法计数结果精密度差异的显著性（P＜0.05，差异显著；P＜0.01，差异极显著[29]）。

配对t-检验结果如表4所示，其中显示3 次测试（1.3.4、1.3.5、1.3.6节）的P值分别为0.532、0.894、0.672，均大于0.05，说明封闭式培养与敞开式培养的计数结果精密度差异不显著，即对于食品中霉菌的检测，封闭式培养方法与敞开式培养计数结果的精密度不存在统计学意义上的差异。

表4 敞开式培养与封闭式培养标准差的配对t-检验结果Table 4 Paired t-test results of standard deviations between open culture and closed culture

2.7 敞开式培养与封闭式培养计数数据的配对t-检验

采用1.4节统计分析方法分别对敞开式培养与封闭式培养的培养皿计数结果（Xi与Yi、Mj与Nj、Pk与Qk）进行配对t-检验（在配对t-检验前需将培养皿计数结果进行对数转换以使其符合正态分布或近似正态分布[30]），配对t-检验结果如表5所示。其中显示3 次测试的P值分别为0.281、0.105、0.681，均大于0.05，说明封闭式培养与敞开式培养的计数结果的差异不显著[29]，即对于食品中霉菌的检测，封闭式培养方法与敞开式培养计数结果不存在统计学意义上的差异。

表5 敞开式培养与封闭式培养计数数据的配对t-检验结果Table 5 Paired t-test results of open culture and closed culture

3 讨 论

在GB 4789.28—2013《食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》[31]中，黑曲霉（菌株编号：ATCC 16404）被用于孟加拉红培养基的技术性验收和质量控制，因此，黑曲霉在孟加拉红培养基的定量测试数据具有广泛的代表性，以其为介质的研究结果，在一定程度上可以推广至食品中霉菌的计数。

通过1.3.2节的测试，获得了黑曲霉的增殖曲线（图1），对于黑曲霉的封闭式培养，在空气与培养基的体积比大于2.8∶1的情况下，当培养至第5天时，黑曲霉的生长不受培养微环境中初始空气体积的限制。而黑曲霉对氧气的消耗性实验（1.3.3节）结果显示在空气与培养基体积比为3∶1的条件下，当培养至5 d时，氧气消耗曲线（图2）未显示培养微环境中初始空气体积能显著影响封闭式培养过程中黑曲霉的生长。因此将封闭式培养的空气与培养基的体积比为3∶1，以进行后续的霉菌封闭式培养与敞开式培养的比对测试。

通过3 次测试的标准差分析发现，对于封闭式培养计数结果的标准差大于敞开式培养的比例，1.3.4节中为53%、1.3.5节中为44%、1.3.6节中为50%，说明两种培养方法的标准差的差异不明显。而敞开式培养与封闭式培养的标准差配对t-检验（2.6节）结果显示，3 次测试的P值分别为0.532、0.894、0.672（表4），均大于0.05，说明封闭式培养与敞开式培养计数结果的精密度差异不显著，即对于食品中霉菌的检测，封闭式培养与敞开式培养计数结果的精密度不存在统计学意义上的差异。

敞开式培养与封闭式培养的复现性相关系数（包括Ri、Rj’、Rk”）计算结果显示，表1中复现性相关系数的最大值为0.144（编号13），表2中的最大值为0.220（编号8），表3中最大值为0.138（样品SP25），3 次测试中所有的复现性相关系数均符合标准[27]关于复现性相关系数R不大于0.45的要求。说明对于食品中霉菌的检测，敞开式培养和封闭式培养的计数结果无显著差异。2.7节中封闭式培养与敞开式培养计数数据的配对t-检验的结果也进一步说明了此问题，表5中3 次测试的P值（分别为0.281、0.105、0.681）均大于0.05，说明封闭式培养与敞开式培养计数结果的差异不显著，即对于食品中霉菌的检测，敞开式培养和封闭式培养对同一样品的计数结果无统计学意义上的差别。

综上所述，本研究结果显示：在空气与培养基体积比为3∶1的条件下，对于霉菌的检测，封闭式培养方法与标准中明示的敞开式培养方法的计数结果无统计学意义上的差别，二者具有相同的代表性和准确性。据此可以建立以空气与培养基的体积比不小于3为参数的霉菌的封闭式培养方法，该方法用自封袋将目标培养皿隔离形成霉菌生长的相对独立的微环境，以防止霉菌孢子逃逸至自封袋外部，从而杜绝霉菌孢子的扩散污染。用建立的封闭式培养方法取代传统的敞开式培养方法，可以解决霉菌检测中孢子扩散及污染的难题。因此本研究结果不仅具有较佳的理论价值，还有极其重要的实用价值。该成果还可以广泛的推广至各检测实验室以及相关企业用于食品品质的监督与评价，也有助于我国霉菌相关检测标准的完善，以及国家监督水平的提高。