欧阳月红 周乾云 许诺

【摘 要】：无乳链球菌（GBS）是一种引起人畜共患病的病原菌，具有跨物种感染的潜在能力，可以在新生儿、孕妇、免疫力低下者及牛、狗、啮齿动物、鱼类等宿主体内适应生存，并引发相关疾病。目前，在西欧、亚洲、非洲、南美洲各国中已有发现大量人和动物被无乳链球菌感染的病例。疫苗是一种预防传染病的有效手段，但目前仍未有人用或畜用的GBS疫苗上市。本文就GBS对人类与动物的危害、GBS防治策略和人用及兽用无乳链球菌疫苗研发最新进展进行总结，为国内无乳链球菌病的防治工作及无乳链球菌疫苗的研发提供参考。

【关键词】：无乳链球菌;人畜共患菌;疫苗

【中图分类号】R843【文献标识码】A【文章编号】1672-3783（2019）09-03--01

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是一种兼性厌氧的革兰氏阳性双球菌，又名B群链球菌（Lancefield group B streptococcus，GBS），最早在患乳腺炎的奶牛身上分离出来[1]。本文就人类所发现GBS对人畜的危害、GBS防治策略和GBS疫苗研制的最新进展进行讨论和探讨，希望能抛砖引玉借此引起相关研究人员以及政府有关部门对无乳链球菌病这一人畜共患疾病的重视，积极参与并推动对人用及畜用无乳链球菌疫苗研发工作，尽快实现无乳链球菌疫苗研制工作的突破。

1 无乳链球菌的概况

无乳链球菌，属于硬壁菌门（Firmicutes）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、乳杆菌目（Lactobacillales）、链球菌科（Streptococcaceae）、链球菌属（Streptococcus sp），被归为B群链球菌，且是唯一拥有B群特异性抗原的链球菌。GBS最早由Nocard和Mollereau于1887年在牛体内发现[2]，后来，Lancefield和 Hare于1935年在产妇的阴道拭子中发现了GBS，1938年，FILE描述了产后妇女的三例死亡病例。

无乳链球菌是一种在自然界广泛存在的兼性厌氧革兰氏阳性细菌。利用光学显微镜进行观察，可发现单个无乳链球菌呈现为直径在0.6～1.0μm的球形或卵圆形，呈现双球状或链状。在培养时，大多数无乳链球菌在36～37℃和pH 7.4～7.6的条件下生长最佳。无乳链球菌的培养需要血清琼脂培养基、脑心浸液培养基（BHI）等类的高营养培养基。在溶血性方面，大部分无乳链球菌呈现β-溶血，α或γ-溶血则是小部分。

2 无乳链球菌对人类及动物的危害

GBS是一种人畜共患病病原菌，可以在新生儿、孕妇、体质弱者如老年人和艾滋病患者及牛、狗、啮齿动物、鱼类等宿主体内适应生存，并引发相关疾病。世界卫生组织于2014年召开的疫苗产品开发咨询委员会（Vaccine Product Development Advisory Committee，PDVAC）第一次会议上，将GBS确定为导致全世界疾病负担沉重的重要病原体，并被确定为研制疫苗的高度优先选项。

3 无乳链球菌病的主要防治措施

目前针对GBS，人们可以采取抗生素、中草药及疫苗三方面的防治举措，其中，抗生素防治GBS感染是实际所采用的，但后两项举措则还处于试验研究阶段。

抗生素防治GBS，主要采用青霉素、红霉素和克林霉素等，此法无论在人群中或是动物群体中都是防治GBS感染的主要措施。在国外，产前抗生素策略是现今通用预防GBS的策略，但此策略只能降低早发新生儿GBS的发生率，但对晚发GBS感染无影响，对孕妇疾病的影响有限[1]。然而，抗生素的大量与长期使用将会导致药物残留、引起机体内正常菌群的紊乱及产生耐药菌等危害，所以此方法非长久之计。近年来，研究表明，人类体液及动物组织中的GBS抗生素的耐药性呈上升趋势[3]。中草药中的有效抑菌成分对GBS具有一定的防治效果，研究发现，将从迷迭香、穿心莲、博落回、紫草、田基黄、田七须和五倍子等中草药的有效成分添加至饲料中投喂罗非鱼，这可以提高罗非鱼在GBS攻毒实验中的存活率[4]。

与抗生素相比，中草药具有价格低廉，毒副作用少，不产生抗药性等优势，但其免疫防治效果明显小于抗生素与疫苗，尤其在面对一些强毒性及侵袭性病菌的感染时根本无法有效地发挥预防作用。与抗生素和中草药相比，采用疫苗防治GBS虽然在成本较高，但却具有特异性，可有效防御強毒性侵袭性病菌，且不产生耐药性，故采用疫苗防治GBS才是可持续发展的良策。

4 无乳链球菌疫苗

目前研制的GBS疫苗都属于预防性疫苗，治疗性GBS疫苗尚未被研制出来。不同类型的疫苗，其研制的依据存在差异。GBS灭活疫苗、GBS弱毒疫苗、GBS多糖-蛋白结合疫苗和GBS菌蜕疫苗是基于GBS的血清型研制的;而GBS DNA疫苗和GBS基因工程重组亚单位疫苗的研制则分别依据GBS所具有的毒力基因及毒力基因所表达的蛋白。

疫苗免疫效果的检测是疫苗研制及评价工作中的关键。目前，GBS疫苗的免疫效果的检测主要通过检测IgM、白细胞分化抗原CD4和CD8、白介素IL-1、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子TNF-α、核转录因子NF-κB等免疫相关基因的表达水平[5]，血清抗体效价[6]，白细胞吞噬能力及相关酶活力（溶菌酶与超氧化物歧化酶）等[7]，或计算相对保护率。

免疫途径对于疫苗免疫效果的实现具有极大的影响。注射、口服及浸泡是GBS疫苗所常用的三种免疫途径，其诱导免疫应答反应的能力大小：注射>口服>浸泡。其中，注射具有疫苗用量较少、能引起较大的免疫原性等优点，但存在技术要求较高、损伤宿主机体等缺点，适用于人类、牛、犬等体型较大的易感宿主，口服与浸泡则适用于鱼类及蛙类等体型较小的易感宿主。因此，研制口服型疫苗目前是水产业使用疫苗的热点之一。基于动物肠道黏膜免疫系统的深入研究，人们已找到方法去应对口服蛋白类疫苗时因抗原蛋白结构被破坏而失效的困境，即采取微球或微胶囊包埋、乳酸菌活载体表达及运载等方式对免疫原蛋白进行保护，结果表明，这些方法在一定程度上都有效保护了抗原蛋白的结构并使其发挥免疫作用[8]。

4.1 灭活疫苗

灭活疫苗，也称死疫苗，具有制作简便、免疫原性易受灭活操作破坏的特点。近年来，GBS灭活疫苗的生产多采用福尔马林法灭活病原微生物，通常以注射或口服的方式进行免疫[9]。在某奶牛场全群泌乳牛的奶样，检测确定奶样中的主要致病菌为无乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌后，制备得无乳链球菌乳房炎疫苗，该疫苗对无乳链球菌乳房炎具有一定的预防及治疗作用。

4.2 减毒疫苗

减毒疫苗，也称弱毒疫苗、减毒活疫苗，通常通过体外连续传代，具有良好的免疫原性。GBS减毒疫苗目前采用注射和口服进行接种。2015年，李莉萍等[10]通过体外连续传代从前期筛选出来具有良好免疫原性疫苗候选菌株HN01中获得弱毒株YM001，高剂量攻毒实验表明其对罗非鱼具有保护作用。

但因减毒疫苗存在返祖、口服时损伤肠道等缺点，针对口服减毒疫苗引起的肠道损伤，可以通过在饲料中添加黄芪多糖、低聚木糖、木聚糖酶等饲料添加剂，这一类饲料添加剂具有有助于肠道黏膜进行修复的功能。

4.3 新型疫苗

4.3.1 基因工程重组亚单位疫苗

亚单位疫苗，又称组分疫苗，可以通过两种途径获取，一是通过化学分解或有控性的蛋白质水解方法提取病原微生物的目的蛋白;二是利用基因工程技术（DNA重组）来选择表达目的蛋白，由此目的蛋白制成的疫苗称为基因工程亚单位疫苗（subunit vaccine），又称生物合成亚单位疫苗或重组亚单位疫苗，这是目前生产药用蛋白的热门方式，按所用表达宿主的类型主要分为真核表达和原核表达。目前，SIP作为GBS表面蛋白的一种，且在各血清型GBS菌株中具有高度的保守性，因此被作为候选疫苗热门靶点。实验室获取SIP蛋白的手段主要是采用原核表达，其中大肠杆菌（DE3）是表达SIP蛋白的常用菌株[11]。

4.3.2 多糖蛋白结合疫苗

多糖结合疫苗是以是以病原菌荚膜多糖为抗原成分，以具有T细胞依赖性的蛋白质抗原为载体，将两者通过化学方法结合而成的疫苗。因为多糖结合疫苗具有成分均一，安全性较高，对全年龄段的人群都具有较好的免疫原性，且能够发挥长期持久的保护力，多地接种统计数据表明接种多糖结合疫苗在预防肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌所导致的疾病方面效果显著。

因此，多糖结合疫苗是人用疫苗研发的热点。目前，已进入临床试验的人用GBS疫苗基本上都是为多糖蛋白结合疫苗。2016年， Madihi等研究表明一种产妇CRM197-三价B群链球菌疫苗（血清型Ia、Ib和III）在非孕妇和孕妇中具有良好的耐受性，并可诱导囊膜特异性c抗体反应。同年，有报道称三价糖结合GBS疫苗在感染艾滋病毒孕妇中的免疫原性低于未感染的孕妇。

4.3.3 DNA疫苗

基因免疫或核酸免疫，是指将含有编码特定抗原蛋白的基因序列克隆至合适的质粒载体上，制备成核酸表达载体，通过肌肉注射等方式将其导入机体内，通过宿主的表达系统合成抗原蛋白，从而激发机体免疫系统产生特异免疫应答反应。基因免疫过程中所使用的重组DNA表达质粒就是DNA疫苗。

4.3.4 菌蜕疫苗

细菌菌蜕（BGs）是通过PhiX 174裂解基因E在革兰氏阴性菌中表达出跨膜孔道蛋白，在其组装至细胞膜上后，导致细胞内容物经该孔道丧失而产生的包膜结构。因其保留了完整的包膜抗原，且无生命，所以成为一种新型的候选疫苗及递送系统，具有兼顾组合抗原免疫原性、佐剂效应、靶向性载体的作用，同时具有加工容易，易大规模生产等优势[12]。

4.4 不同类型疫苗利弊分析

在免疫原性方面，相较于其他疫苗，弱毒疫苗与菌蜕疫苗都因能比较完整地保存病原菌细胞膜结构而具有显著的优势，而基因工程亚单位疫苗的免疫原性明显较差，但可以通过与其他GBS蛋白融合表达、利用乳酸菌作为活载体表达GBS表面蛋白、添加佐剂等方法提高其免疫原性。在免疫应答的激发与持久性方面，弱毒疫苗与DNA疫苗在免疫动物或人类后，能在其体内进行自我增殖与扩散，因而较其他疫苗在受免疫动物体内所激发的免疫应答更具有持久性。此外，弱毒疫苗还具有能激发细胞免疫的特点，因此适用于开发口服型与浸泡型弱毒疫苗，造福于受GBS等病原菌侵袭而受重创的养殖渔业。

在安全性方面，弱毒疫苗存在返毒的風险，菌蜕疫苗则存在失活彻底存在活性病原菌的风险，而基因工程亚单位疫苗和多糖结合疫苗因其成分较为均一不含核酸，在免疫动物或人类后，不会产生持续感染，因此较其他疫苗具有较高的安全性。基因工程亚单位疫苗还具有可规模化扩大生产、可简便生产多价疫苗、产生的免疫应答能与野毒感染相区分等优势，既可以作为兽用疫苗，也适用于研发人用疫苗。

5 展望

疫苗是预防侵袭性传染疾病的有效手段。最近，国家农业部农牧便函[2019]236号文件提出“为了维护动物源食品安全和公共卫生安全，2020年我国将全面禁止抗生素被用于饲料添加剂”的计划，加快疫苗的研制与投入使用将有利于这项计划的落实。

鉴于GBS具有跨物种传播的风险，世界各地防疫站及医院等机构加强对GBS感染及耐药性的实时监测与报道，这将有利于GBS疫苗研制工作的跟进。另外为了通过普及GBS感染及防治的知识，以提高GBS疫苗接种率来有效预防GBS感染，这需要借助政府机构或相关社会机构如GBSA （Group B Strep Association US/International） 和 GBSS （Group B Strep Support – UK/EU） [6]。我国目前暂无这样的宣传机构，建议政府或GBS相关研究机构能够积极组建。

参考文献

K. Le Doare and Heath P.T. An overview of global GBS epidemiology[J]. Vaccine， 2013， 31 Suppl 4： D7-12

M.R. Nocard N. Sur une mammite contagieuse des vaches laitieres[J]. Ann Inst Pasteur， 1887， 1： 109–26

周燕珍， 王利民， and 方寅飞. 无乳链球菌致新生儿血流感染的血清型与耐药性研究[J]. 中国卫生检验杂志， 2017， 27（8）： 1190-1193

华亚南， 张丽， and 许国焕. 中草药防治罗非鱼无乳链球菌病的研究进展[J]. 广东饲料， 2016， 0（B11）： 42-44

林楠. 罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗免疫效果研究[J]. 福建农业学报， 2018， 33（4）

王蓓. 罗非鱼无乳链球菌DNA疫苗的构建及免疫效果研究[J]. 中国海洋大学学报：自然科学版， 2013（12）

朱洁莲. 罗非鱼源无乳链球菌灭活疫苗免疫效果的研究[J]. 中国兽医科学， 2017， 47（5）

高铭蔚. 罗非鱼无乳链球菌PLGA微球口服疫苗免疫效果的研究[J]. 免疫学杂志， 2015， 0（2）

陈贺. 无乳链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫效果[J]. 广东海洋大学学报， 2012， 32（6）

李莉萍. 罗非鱼无乳链球菌弱毒株与其母源株部分生物学特性及免疫原性比较研究[J]. 西南农业学报， 2015， 28（5）

胡长敏. SIP亚单位疫苗对无乳链球菌诱导小鼠乳腺炎的保护力评价[J]. 中国奶牛， 2012（3）

李绍戊 and 卢彤岩. 菌蜕系统作为新型渔用疫苗体系的研究进展[J]. 生物技术通报， 2012（11）： 43-48