马 群，汪彩莉，李晓环，程险峰，汪棉坤

（湖北白云边酒业股份有限公司，湖北松滋 434200）

大曲是酿酒生产的主要糖化发酵剂，素有“曲乃酒之骨”之称。糖化力指的是大曲中具有糖化作用的微生物及酶将淀粉分解为葡萄糖的能力，是衡量大曲糖化作用强弱的一个重要指标，是大曲最为重要的理化考核指标之一。准确分析大曲糖化力对指导酿造生产的意义重大。斐林试剂法测定糖化力滴定终点颜色变化明显，易于分辨。白云边酒是兼香型的典型代表，具有独特的生产工艺。白云边采取高温曲、中温曲分开制曲，结合使用的方式进行。而高温曲和中温曲糖化力差别巨大，依靠传统的检测方法很容易出现检测误差。所以本文针对这一特殊现象，在原有检测方法的基础上进行了适当的调整，探索更适合白云边大曲糖化力的检测方法，保证检测结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 试验材料

白云边成品曲仓库随机抽取储存期达到3 个月以上的高温大曲。

1.1.2 试剂葡萄糖标准溶液（1.0 g/L）：准确称取已烘干的无水葡萄糖1.0 g，用水溶解，加约5 mL 浓盐酸（防腐），并用水溶至1000 mL。

醋酸-醋酸钠缓冲溶液（pH4.6）

2 mol/L醋酸溶液：量取118 mL冰醋酸，加水稀释至1000 mL。

2 mol/L 醋酸钠溶液：称取272 g 醋酸钠(CH3COONa·3H2O)，加水溶解，并用水稀释至1000 mL。将以上两种溶液等体积混合均匀。

淀粉溶液（20 g/L）：称取20.00 g 预先以100～105 ℃烘干2 h 的可溶性淀粉，用水调成糊状，不断搅拌下注入800 mL 沸水，继续煮沸至透明，冷却后，在1000 mL 容量瓶中定容至刻度，摇匀，当天配制使用，若使用量减小，可按比例减少配制量。

氢氧化钠溶液C(NaOH)＝0.1 mol/L：称取4 g 分析纯氢氧化钠，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000 mL，摇匀，贮存于聚乙烯瓶中（不必标定其准确浓度）。

斐林试剂甲液：称取15 g硫酸铜（CuSO4·5H2O）、0.05 g次甲基蓝，用水溶解并稀释至1000 mL。

斐林试剂乙液：称取50 g 酒石酸钾钠、54 g 氢氧化钠、4 g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释至1000 mL。

1.1.3 仪器设备

恒温水浴锅、250 mL 烧杯、50 mL 容量瓶、滴定管、三角瓶、电炉。

1.2 试验方法

1.2.1 原糖化力检测方法

固体曲浸出液的制备：按计算量，称取相当于5.00 g 绝干曲的试样量，置于250 mL 烧杯中，加入90 mL 水及pH4.6 的醋酸-醋酸钠缓冲溶液10 mL，搅匀。置烧杯于35 ℃恒温水浴中保温1 h，间隔15 min搅拌1 次。浸出液用脱脂棉或多层纱布过滤，滤液尽快测定。

糖化液的制备：吸取25.0 mL 的20 g/L 淀粉溶液于50 mL容量瓶中，加pH4.6的缓冲溶液5 mL，将容量瓶置于35 ℃水浴中保温10 min。加入5.00 mL固体曲浸出液，立即混匀计时。准确于35 ℃下保温1 h，迅速加入15 mL 的0.1 mol/L 氢氧化钠溶液，终止酶解反应。冷却至室温后，用水定容至50 mL，摇匀，得到糖化液。

空白对照：吸取25.0 mL 20 g/L淀粉溶液于50 mL容量瓶中，加入pH4.6 的缓冲溶液5 mL。先加入15 mL 的0.1 mol/L 氢氧化钠溶液，然后再准确加入5.00 mL固体曲浸出液，用水定容至50 mL，摇匀。

测定：吸取斐林试剂甲液、乙液各5.0 mL 于150 mL 三角瓶中，加入5.0 mL 制备好的糖化液，自滴定管中加入一定量1.0 g/L 的葡萄糖标准溶液(使随后滴定时其用量不超过1 mL)，于电炉上加热至沸腾，保持沸腾2 min，在沸腾状态下继续用1.0 g/L葡萄糖标准溶液滴定至蓝色刚好消失而呈浅黄色，记录葡萄糖标准溶液的总用量。此滴定操作需在1 min内完成。其消耗的1.0 g/L葡萄糖标准溶液应控制在1 mL内。同时作一空白试验。

空白试验：吸取斐林试剂甲液、乙液各5.0 mL于三角瓶中，加入5.0 mL 制备好的空白液，以下操作同试样的测定。

计算：固体曲糖化力的定义：在35 ℃，pH4.6时，1 g 绝干曲1 h 内酶解可溶性淀粉为葡萄糖的量。

式中：X——糖化力，葡萄糖mg/g·h；

V0——空白试验葡萄糖标准溶液的用量，mL；

V——试样测定葡萄糖标准溶液用量，mL；

ρ——葡萄糖标准溶液的浓度，g/mL；

m——以绝干曲计的试样称取量（5.00 g）；

t——酶解时间，h。

1.2.2 传统检测方法的弊端分析

斐林试剂法测大曲糖化力，滴定终点颜色变化明显，易于分辨。由于生产工艺的不同，高温大曲和中温大曲的糖化力差别较大，白云边公司高温曲糖化力的标准是100～300 mg/g·h，中温曲糖化力的标准是≥500 mg/g·h。然而对于计算公式：

如果斐林试剂甲液、乙液按5 mL 来计算，V0值一般小于10.0 mL。将公式中ρ 为0.1 % g/ mL，m为5.00 g，t 为1 h。分别代入公式计算得出X=（V0-V）×40，也就是说糖化力的最大测定值为400 mg/g·h，即在V 值为0 时测得，V 值为0 的试验现象就是在测定时加入测试的糖化液后，不需要再加入标准葡萄糖液滴定，溶液直接变为浅黄色，到达滴定终点。这种试验现象表明，样品中加入的糖化液足够将5 mL斐林试剂甲液、乙液氧化，不需要再滴定葡萄糖标准溶液。也就是说在糖化力大于400 mg/g·h 时无法测得准确结果，即测定高温曲的糖化力采用此方法是适用的，但是中温曲的糖化力一般大于500 mg/g·h，用此方法则测定不出准确结果。

1.2.3 检测方法的优化

1.2.3.1 加大斐林试剂甲液、乙液的用量

在其他测试液用量不变的条件下，加大斐林试剂甲液、乙液的用量，将原检测方法中的5 mL 增加为10 mL，代入计算公式后V0则增大为以前的2倍，此时的V0≤20.0 mL，代入计算公式X=（V0-V）×40，在V 值为0 时，X 的最大测定值为800 mg/g·h。当中温曲的糖化力小于800 mg/g·h时，用这种方法可以测定出准确结果。

1.2.3.2 减少试液用量

斐林试剂甲液、乙液用量不变，在1.2.1 中的糖化过程中，固体曲浸出液的吸取量由原先的5.0 mL减少为2.0 mL；在1.2.1 的测定过程中，糖化液的加入量也由原先的5.0 mL 减少为2.0 mL。此时原来的公式中的系数也有相应改变：

将公式中ρ 为0.1%g/mL，m 为5.00 g，t 为1 h。分别代入公式计算得出X=（V0-V）×250，计算公式中的系数由原来的40 增大至250，在V0≤10.0 时，X的最大测定值为2500 mg/g·h。最大测定值远远高于白云边公司中温曲的糖化力。所以减少试液用量的方法测定中温曲糖化力是可行的。

2 结果与分析

2.1 比较两种优化后的试验方法

为了比较两种方法测定结果的准确度和精密度，我们取了同一个中温曲样品，分别用两种试验方法测定，每种方法都测定了7 组数据。为了便于统计，我们把增大斐林试剂甲液、乙液用量的方法称为方法一，减少试液用量的方法称为方法二。两种测定方法测得的糖化力结果见表1。

表1 中温曲糖化力测定结果对照表 (mg/g·h)

2.2 准确度的比较

准确度是指测量值与真实值之间相符合的程度。准确度的高低常以误差的大小来衡量。即误差越小，准确度越高；误差越大，准确度越低。由于样本的真实值是不可知的，在日常分析工作中，总是对某试样平行测定，取其算术平均值作为真实值。从表1 可知，用方法一测得样品糖化力的平均值为680 mg/g·h，可以作为方法一测得的真实值用于计算该组数据的相对误差；用方法二测得样品糖化力的平均值为675 mg/g·h，可以作为方法二测得的真实值用于计算该组数据的相对误差。相对误差是指误差在真实值中所占的百分率。相对误差的表示方法是：

图1 糖化力测定值相对误差对比图

由图1 可以看出，用方法二测定的一组数据的相对误差值明显要比用方法一测定的大，即方法一测定糖化力大小的准确度要显著高于方法二。

2.3 精密度的比较

精密度是指在相同条件下n 次重复测定结果彼此相符合的程度。精密度的大小用偏差表示，偏差愈小说明精密度愈高。绝对偏差表示单个样本的精密度，用测定值减平均值来表示。

在数理统计中，一般测定次数有限，常用样本标准偏差来表示精密度，其数学表达式（贝塞尔公式）为：

上式中xi为单个样本值，为样本平均值。（n-1）在统计学中称为自由度，即在n 次测量中，只有（n-1）个独立可变的偏差，因为n 个绝对偏差之和等于0，所以只要知道（n-1）个绝对偏差，就可以确定第n个的偏差值。

表2 糖化力测定值绝对偏差对照表

方法一和方法二两种测量结果，每次测量值的绝对偏差见表2。

通过表2 的绝对偏差值（xi）代入贝赛尔公式计算样本标准偏差（S）分别为：

比较样本标准偏差S1和S2可以说明第1 组数据的精密度高。因为第2 组数据较集中且接近标准数据。由此可见，欲使准确度高，首先必须要求精密度也要高，但精密度高并不说明准确度也高，因为可能在测定中存在系统误差，但精密度是保证准确度的先决条件。

3 结论

应用数理统计的方法我们比较了两种方法测定结果的准确度和精密度，结论是方法一测定结果的准确度和精密度都高于方法二。因为在测定过程中定糖时滤液吸取量和斐林试剂甲液、乙液的用量改变了，这种改变使糖化力含量计算公式后面的系数发生变化。

滴定管的最小刻度是0.1 mL，即在滴定终点时，葡萄糖用量相差0.1 mL，用方法一就会带入4 mg/g·h的绝对误差，而方法二则代入25 mg/g·h 的绝对误差。而滴定管在到达滴定终点时，由于滴定操作的差异，容易造成±0.1 mL～±0.3 mL 的滴定误差。这就给测得的结果带来相应误差，方法一会带入±4 mg/g·h～±12 mg/g·h 的相对误差，方法二则是±25 mg/g·h～±75 mg/g·h 的相对误差。也就是说，定糖操作时用方法一可以尽最大可能地减少由于人为操作引起的滴定误差。

在日常的化验工作中我们应该针对具体问题具体分析，白云边高温曲直接用原实验方法就能很准确的测定出糖化力。基于准确度和精密度考虑，测定白云边中温曲糖化力时我们宜选用优化方案一，若糖化力高于800 mg/g·h，用方案一无法测定准确结果时，则改为方案二。