闫海龙 陈乐琴 张一民 苏浩 汪赞

摘 要：目的：探讨高强度间歇性训练（HIIT）与中等强度持续运动对肝细胞自噬与凋亡相关因子表达的影响与差异，为运动防治急慢性肝病提供实验依据。方法：9月龄雄性wistar大鼠70只，随机分为基础值组（B，10只），4周安静对照组（Q1，10只），4周中等强度运动组（M1，10只），4周HIIT组（H1，10只）和8周安静对照组（Q2，10只），8周中等强度运动组（M2，10只），8周HIIT组（H2，10只）。安静对照组大鼠不运动，中等强度运动组以60%VO2max强度进行持续训练，HIIT组以50%VO2max、60%VO2max、80%VO2max的强度交替训练。跑台训练每天50 min，每周5 d。基础值组大鼠在首次最大摄氧量测试后24～48 h取材，安静对照组与干预组大鼠在干预后第4、8周最大摄氧量测试结束后24～48 h取材。采用HE染色观察肝细胞形态，采用Western Blot检测肝细胞中LC3-Ⅱ、p62、Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达情况。结果：1）不同运动方式干预组之间细胞形态结构无明显差别，8周各组相比4周各组细胞间隙略有增大。2）与同周安静对照组相比，8周中等强度运动组大鼠肝细胞LC3-Ⅱ蛋白表达显著上调（P<0.05），p62蛋白表达显著下调（P<0.05）。而8周HIIT组上调LC3-Ⅱ、下调p62蛋白表达的效果更显著（P<0.01）。3）与同周安静对照组相比，中等强度持续运动组在4周与8周均显著下调Bax/Bcl-2（P<0.01），Caspase3蛋白表达在8周时显著下调（P<0.01）。而HIIT在4周时下调Bax/Bcl-2比中等强度持续运动更为显著，但到8周时Bax/Bcl-2比率却回升到与安静组无显著差异（P>0.05），对Caspase3蛋白表达也表现出相同趋势，4周时显著下调（P<0.01），8周时与安静组无显著差异（P>0.05）。结论：1）8周HIIT可有效上调大鼠肝细胞LC3-Ⅱ蛋白表达，下调p62蛋白表达，提高肝细胞自噬水平，相对于传统的中等强度持续运动更为有效;2）8周中等强度持续运动可有效下调大鼠肝细胞Caspase3蛋白表达，下调Bax/Bcl-2比值，降低肝细胞凋亡水平，相对于HIIT更为持续有效。

关键词：高强度间歇训练（HIIT）;LC3-Ⅱ;p62;Bcl-2;Bax;Caspase3

中图分类号：G804.2 文献标识码：A文章编号：1006-2076（2019）03-0071-07

肝脏是人体内最大的腺体，也是功能最复杂的器官之一，因为它对解毒、合成和释放生物分子以及对运动肌肉的能量供应有主要作用。最近，肝脏也被证明在运动中对氧化还原状态和炎症调节起着重要的作用[1]。肝脏经常受到一系列有害刺激的影响而导致肝细胞死亡，在持续的破坏积累下，细胞死亡会导致炎症、纤维化、肝硬化，最终导致肝细胞癌[2-3]。导致肝细胞死亡主要是由细胞凋亡和坏死引起的，也会因自噬等某些复杂情况引起[3-4]。

细胞自噬和凋亡是维护细胞和组织内稳态的两种重要的分解代谢过程[5]。各类研究已经证实，它们在决定细胞命运方面有着紧密且复杂的联系。自噬可以通过提高半胱天冬蛋白酶（Caspase）活性导致细胞死亡，也可以作为一个应激反应，延迟Caspase酶的激活使细胞存活，并移除受损的细胞器[6]。凋亡抑制蛋白Bcl-2与Bcl-xL又可以与自噬因子Beclin-1相互作用抑制自噬[7]。新的证据表明，这两种途径中核心蛋白之间的相互作用是细胞凋亡与自噬之间关联的分子机制基础[8]。时至今日，自噬已经成为继凋亡之后生命科学领域最热门的研究之一，通过运动训练调节细胞自噬水平越来越成为人们研究的靶点，而目前有关运动对肝细胞自噬的影响研究尚少，细胞凋亡与自噬之间的调控机制也未完全明确。

高强度间歇性训练（High intensity interval training，HIIT）是一种以超过无氧阈强度或是接近于或大于最大摄氧量强度进行重复多次的相对较短时间（如10 s～5 min）运动的方式。研究表明，它可以有效调节血糖水平[9]，提高体内抗氧化酶的活性，降低氧化应激水平[10]。与中等强度持續运动相比，HIIT在预防和减少肝脂肪沉积、减轻脂肪组织炎症和改善胰岛素敏感性方面更有效[9，11]。众多研究已经显示，细胞凋亡与自噬是运动锻炼促进机体健康的重要生理机制。本研究通过选取传统的中等强度持续运动与目前备受关注的高强度间歇训练两种干预方式，来探讨它们对肝细胞自噬与凋亡相关因子表达的影响与差异，为运动防治急慢性肝病提供新的实验依据。

1 对象与方法

1.1 实验对象与分组

本研究选取9月龄清洁级雄性wistar大鼠70只。将大鼠适应性喂养1周后，随机分为基础值组（B，10只），4周安静对照组（Q1，10只），4周中等强度运动组（M1，10只），4周HIIT组（H1，10只）和8周安静对照组（Q2，10只），8周中等强度运动组（M2，10只），8周HIIT组（H2，10只）。所有大鼠均在清洁级环境下分笼饲养，自由采食与饮水，动物房温度为25℃，12小时明暗周期交替。

1.2 实验运动方案

安静对照组：不进行运动。

中等强度运动组：大鼠进行跑台训练。实验运动前先进行VO2max测试。根据测试结果，确定运动强度为60%VO2max强度[12]进行训练，每天50 min，每周5 d。

HIIT运动组：运动干预前根据大鼠最大摄氧量测试结果，根据大鼠达到最大摄氧量时的跑台运动速度，参考梁春瑜等[13]方案设计，确定HIIT运动方案进行为期8周的训练，每天训练50 min，每周训练5 d，运动方案见表1。干预组大鼠每两周进行一次最大摄氧量测试，根据最大摄氧量测试结果重新调整运动强度。

1.3 VO2max测试方案

所有大鼠在正式实验开始前及训练至第2，4，6，8周末时均进行VO2max测试。最大摄氧量测试根据Leandro 等[14]的研究进行改良，具体测试方案见表2。大鼠达到最大摄氧量的判断标准为：1）大鼠在电刺激的情况下不能在跑台上继续跑。2）两级之间的VO2max/一级速度之间相差小于5%。测试仪器为开放环路量热计（OxymaxDeluxe System，哥伦布仪器，美国）。

1.4 取材

基础值组大鼠在首次最大摄氧量测试结束后24～48 h取材，安静对照组与干预组大鼠在干预后第4，8周最大摄氧量测试结束后24～48 h进行取材。2%戊巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，迅速摘取肝脏称重，切取肝脏右叶投入液氮中，随后转入-80℃冰箱中保存，用于western-blot测试。

1.5 肝组织学样本制备

将大鼠肝组织石蜡切片依次经脱蜡、水化、苏木素染色、分化、反蓝、伊红染色、脱水、透明、封片，制成HE染色切片。置于光学显微镜下观察、采图。

1.6 Western Blot 检测

取肝脏100 mg加入1 mL含有蛋白酶抑制剂的裂解液中低温匀浆，使细胞充分裂解后置于4℃离心机离心，12 000转离心10 min，取上清液。随后用Thermo Fisher的BCA试剂盒测定并调整蛋白浓度一致，加入蛋白上样缓冲液，配平上样量，70℃水浴10 min使蛋白变性后分装样品。

加样到预制胶（NuPAGE Novex 12%Bis-Tris Gel）置于电泳槽，加入5%体积的电泳缓冲液，120 V电泳90 min;转膜（转膜缓冲液：Tris 3.03 g/L、甘氨酸14.41 g/L、甲醇200 ml/L、蒸馏水）约90 min;5%脱脂奶粉封闭1 h;一抗（Abcam：GAPDH—Ab181602，P62—Ab109012，Bax—Ab32503;Cell Signaling： Caspase3—9664s;Santa Cruz：Bcl-2—Sc-7382;Nuvos：LC3—NB100-2220）封闭4℃摇床过夜，次日用TBST洗膜8 min×4;二抗（Abcam：GAPDH、P62、Bax、Caspase3—羊抗兔Ab6721;Thermo：Bcl-2—羊抗鼠A16078）封闭1 h，后用TBST 洗膜8 min×4;化学发光成像系统（Bio-rad公司，美国）曝光显影。

1.7 数据处理与分析

测试条带采用Image Lab 4.0进行数据采集。所有实验数据用平均数±标准差（[AKX-]±SD）表示，运用SPSS17.0进行数据统计分析，采用Levene检验进行方差齐性检验，单因素方差分析（One-way ANOVA）进行差异性分析。以P<0.05为显著性差异标准，以P<0.01为非常显著性差异标准。

2 结果

2.1 肝组织形态

图1显示，不论是基础值组还是安静组与运动干预组，大鼠肝细胞结构完整，细胞核大且呈圆形。不同运动方式干预组之间细胞形态结构无明显差别。8周各组相比4周各组细胞间隙略有增大，但细胞轮廓清晰，排列整齐，表明8周的HIIT与中等强度运动干预并未对肝细胞形态结构造成明显影响，运动干预没有过量。

2.2 各组大鼠肝细胞自噬因子LC3-Ⅱ、p62蛋白表达结果

图2显示，安静组LC3-Ⅱ蛋白表达无显著变化（P>0.05）。中等强度运动组LC3-Ⅱ蛋白表达总体呈上升趋势，但到8周时才出现显著性差异，此时M2组比Q2组LC3-Ⅱ蛋白表达显著上升34.8%（P<0.05）。HIIT组与同周安静组相比，LC3-Ⅱ蛋白表达在4周时略有下降但无显著性差异（P>0.05），8周时却显著上升，此时H2组比Q2组LC3-Ⅱ蛋白表达显著上升52.7%（P<0.01）。H2组LC3-Ⅱ蛋白表达高于M2组，但无显著性差异（P>0.05），H2组比H1组LC3-Ⅱ蛋白表达显著上升53.9%（P<0.01）。

这表明8周HIIT与中等强度持续运动干预可以显著上调LC3-Ⅱ蛋白表达，且HIIT的干预效果要优于中等强度持续运动。

图3显示，安静组p62蛋白表达无显著变化（P>0.05）。中等强度运动组p62蛋白表达呈下降趋势，M1组、M2组与同周安静组相比p62蛋白表达分别显著下降19.9%、21.1%（P<0.05）。HIIT组与同周安静组相比，p62蛋白表达4周时无显著差异（P>0.05），8周时H2比Q2显著下降32.2%（P<0.01）。同时H2组比H1组p62蛋白表达显著下降31.7%（P<0.01）。

这表明8周HIIT与中等强度持续运动干预可以显著下调p62蛋白表达，且HIIT的干预效果要优于中等强度持续运动，但中等强度持续运动的下调效果在4周时就表现出显著性。

2.3 各组大鼠肝细胞凋亡因子Caspase3 、Bcl-2、Bax蛋白表达结果

图4显示，安静组Caspase3蛋白表达无显著变化（P>0.05）。中等强度运动组Caspase3蛋白表达总体呈下降趋势，但到8周时才出现显著性差异，此时M2组比Q2组Caspase3蛋白表达显著下降38.4%（P<0.01）。HIIT组Caspase3蛋白表达先下降后上升，与同周安静组相比，H1显著下降36.6%（P<0.01），H2组已基本上升到比Q2组略低水平（P>0.05），H2比H1组显著上升61.8%（P<0.01）。H1组比M1组显著下降36.6%（P<0.01）。

这表明HIIT对Caspase3蛋白表达的下调效果主要在4周時，而中等强度持续运动对Caspase3蛋白表达的下调效果主要在8周时。

图5显示，在Bcl-2蛋白表达结果中，安静组无显著变化（P>0.05）。4周时与Q1组相比，M1组显著上升22%（P<0.05），H1组显著上升45%（P<0.01），H1组显著高于M1组（P<0.01）。8周时与Q2组相比，H2组显著下降15.2%（P<0.05），H2组相比H1组显著下降38.2%（P<0.01）。

在Bax蛋白表达结果中，安静组无显著变化（P>0.05）。4周时与Q1组相比，M1组显著下降16.5%（P<0.05），H1组显著下降28%（P<0.01）。8周时与Q2组相比，M2组与H2组均无显著性变化。

在Bax/Bcl-2比值结果中，安静组无显著变化（P>0.05）。中等强度运动M1组、M2组与同周安静组相比分别显著下降28.7%、26.7%（P<0.01）。HIIT组Bax/Bcl-2比值先下降后上升，与同周安静组相比，H1显著下降51.4%（P<0.01），H2组已上升到比Q2组略高但无显著性（P>0.05），且H2组比H1组显著上升1.17倍，同时H2组显著高于M2组（P<0.01）。

这表明在对Bax与Bcl-2调控下的凋亡水平干预中，中等强度持续运动在4周和8周都显著下调了凋亡水平。而HIIT主要在4周时下调凋亡水平，且4周的干预效果优于中等强度持续运动。

[TP3q20.TIF，BP#][TS（][HT5"K][JZ]图5 各组大鼠肝细胞免疫印迹Bax/Bcl-2结果比较[TS）]

3 讨论

3.1 不同运动方式对大鼠肝细胞自噬因子LC3-Ⅱ、p62蛋白表达影响

自噬（autophagy）是真核细胞中高度保守且普遍存在的生命现象，主要用于降解和回收利用细胞内不被需要的生物大分子、受损伤的细胞器等[15]。自噬过程中，细胞通过双层膜结构包裹细胞内需要降解的内源性物质形成自噬体（autophagosome）。与此同时，一种微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）的胞浆形式LC3-Ⅰ与和磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine， PE）偶联形成LC3-Ⅱ，并稳定定位于自噬体内外膜表面。因此，LC3-Ⅱ被认为自噬活动的特异性标志物。通常用LC3-Ⅱ蛋白表达量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值来衡量自噬活性[16]。但是由于LC3-Ⅱ对抗体的敏感性高于LC3-Ⅰ，实际检测结果LC3-Ⅰ的减少并不与LC3-Ⅱ的增加同步，因此单纯比较LC3-Ⅱ蛋白的水平可能更合适[17]。p62是SQSTM1编码的泛素结合蛋白，是自噬的选择性底物之一。当自噬被激活时，p62 可连接LC3和泛素化的底物运送至自噬体，在自噬体与溶酶体结合成的自噬溶酶体（autolysosome）中被一同降解。因此，对LC3与p62的免疫分析被用于监测自噬流（autophagic flux）的变化[18]。

赵军等[19]研究发现，通过对高脂喂养的大鼠进行23周有氧运动干预，可以显著提高肝细胞LC3-Ⅱ蛋白表达水平，抑制ROS的生成，而高脂安静组大鼠ROS生成增多，氧化应激水平提高，发生肝炎和肝纤维化。Rosa[20]等也通过对高脂喂养与常规喂养的老鼠进行4周自由转轮运动干预，发现不管是高脂喂养还是常规喂养的老鼠均提高了肝脏基础自噬水平，且相同喂养方式的运动组与安静组相比，肝细胞LC3-Ⅱ蛋白表达均显著上升，p62蛋白表达均显著下降。提示长期规律运动可以通过提高肝细胞自噬水平，减少受损细胞器的积累，满足能量供应，抑制氧化应激，从而减少肝脂质沉积和肝内炎症，阻止肝纤维化的发生，保护肝脏健康。本研究结果显示，8周HIIT与中等强度持续运动均可显著上调肝细胞自中LC3-Ⅱ蛋白表达，显著下调p62蛋白表达。但8周时HIIT相比中等强度持续运动上调LC3-Ⅱ、下调p62蛋白表达的效果更显著。Wang Ningning[11]等研究也发现，相对于传统中等强度持续运动，8周的HIIT对于阻止肝脂肪沉积和调节代谢功能方面更为有效。推测长期的HIIT对肝细胞自噬因子LC3-Ⅱ与p62蛋白表达的影响更大。值得注意的是，4周时HIIT组的LC3-Ⅱ与p62蛋白表达基本与安静组一致，而中等强度持续运动组的LC3-Ⅱ蛋白表达已有少量上升，p62蛋白表达更是已出现显著下降，提示中等强度持续运动对肝细胞LC3-Ⅱ与p62蛋白表达的影响早于HIIT。

3.2 不同运动方式对大鼠肝细胞凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达影响

细胞凋亡（apoptosis）是由基因控制的细胞自主性死亡的过程，在众多调控凋亡的因子中Bcl-2家族和Caspase家族发挥着重要作用。B细胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）是凋亡抑制基因，Bcl-2相关X蛋白（Bax）是促进凋亡的基因，Bax/Bcl-2的比率形成了细胞凋亡的“分子开关”，Bax/Bcl-2升高细胞趋于凋亡，反之细胞凋亡受到抑制。而凋亡的细胞死亡最终由Caspase家族完成。半胱天冬蛋白酶-3（Caspase3）处于Caspase级联反应的中心位置，是细胞凋亡的执行者，当它被上游信号激活后，会自身切割为有活性的状态，并水解下游底物，切断DNA，导致细胞凋亡[21]。一旦Caspase3被激活，细胞死亡将不可被逆转[22]。

研究发现，在游泳至力竭后的老鼠海马体中即刻发现细胞内Ca2+显著增多，凋亡细胞的数量显著增加，Caspase3蛋白表达显著增加，说明力竭运动后细胞内Ca2+的超载是引发凋亡增多的原因之一[23]。对大鼠进行5周游泳运动后，急性力竭运动组心肌组织的SIRT1和Bcl-2蛋白表达明显减少，Bax和心肌细胞凋亡显著增加，急性力竭加耐力训练组Bax和心肌细胞凋亡明显减少，急性力竭加耐力训练加SIRT1抑制组SIRT1和Bcl-2蛋白表达明显更低，Bax和细胞凋亡明显更高[24]，表明SIRT1信号通路的激活和耐力运动可以抑制细胞凋亡，保护心肌细胞。人体实验也发现[25]，在短时间高強度运动后，周围血液中白细胞的MTP立即下降，白细胞在运动过程中和运动后逐渐趋于凋亡，同时在运动过程中，肿瘤坏死因子和可溶性Fas配体的血浆浓度升高，表明短时间高强度运动可导致外周血白细胞凋亡的增加和促炎症介质的增加。金其贯[26-27]等研究认为，适量的运动训练可使大鼠骨骼肌细胞中Bcl-2蛋白表达增加，长期运动训练使骨骼肌细胞中Bax蛋白表达下降。以上研究表明：运动形式、运动量和运动时间对Bcl-2、Bax、Caspase3的蛋白表达以及细胞凋亡会产生不同影响，短时间大强度或力竭运动会使促凋亡蛋白表达升高，抗凋亡蛋白表达降低;而长期规律运动才能有效抑制细胞的凋亡，保护机体免受外界刺激诱发的细胞损伤。本实验中，中等强度持续运动在4周与8周均显著下调Bax/Bcl-2比值，对Caspase3蛋白表达主要在8周时显著下调。Luo[28]等实验也表明，6周的耐力训练能明显减少肝细胞凋亡数目。而HIIT在4周时下调Bax/Bcl-2比中等强度持续运动更为显著，但到8周时Bax/Bcl-2比率却回升到与安静组无显著差异，对Caspase3的蛋白表达也表现出相同的趋势，4周时显著下调，8周时与安静组无显著差异，表明HIIT对Bax/Bcl-2与Caspase3蛋白表达主要在4周时下调，而中等强度持续运动在这方面表现得更为持久。

3.3 肝細胞自噬与凋亡关系的探讨

大量研究表明，细胞自噬和凋亡广泛存在于真核细胞生物体内，是维护细胞和组织内稳态的两种重要分解代谢过程[5]。尽管凋亡与自噬的特征及机制不同，但两种途径并不是相互独立的，它们有共同的刺激因子和调节蛋白，两种途径之间存在着复杂的对话。根据二者调控方式的不同，可大致将其交互作用归纳为两种：合作关系和拮抗关系。自噬与凋亡表现为合作关系在现有研究中较为多见。该种情况下，自噬与凋亡的调控目标都是促进细胞死亡。或各自同步引发细胞死亡，或—种为主，另一为辅，也可在—方功能缺陷的情况下，另一方替补诱导细胞死亡。很多诱导凋亡的刺激常常也会诱导自噬，例如在治疗肺癌的研究中发现，姜黄素可以同时诱导癌细胞凋亡和自噬来抑制癌细胞的增殖[29]。研究发现，烟草烟雾可以通过激活活性氧同时诱导细胞凋亡和自噬增加，从而抑制胎盘的发育[30]。拮抗关系中，自噬与凋亡相互抑制，细胞自噬的上调抑制凋亡的发展，促使细胞存活。例如在骨质疏松症的病理过程中发现，成骨细胞自噬可有效抑制氧化应激介导的细胞凋亡，这是治疗骨质疏松症的潜在靶标[31]。在老鼠的癌症模型中发现，自噬通过抑制p53的反应来促进肿瘤生长，维持线粒体功能，在压力下维持代谢平衡和生存，防止癌细胞凋亡[32]。张昊[33]等也发现，运动训练通过上调的自噬相关蛋白Atg5、Beclin1、LC3的表达，抑制心肌细胞凋亡，改善老龄大鼠心脏功能。

本实验中对肝细胞自噬与凋亡相关因子表达的检测显示，8周中等强度持续运动可以持续上调肝细胞自噬水平，下调肝细胞凋亡水平。而HIIT对肝细胞的影响整体上也表现出上调自噬水平与下调凋亡水平的情况，但与中等强度持续运动相比，HIIT在4周时主要表现在下调肝细胞凋亡水平，且比中等强度持续运动下调凋亡的程度大，而在8周时HIIT主要表现在上调肝细胞自噬水平，且比中等强度持续运动上调自噬的程度大。表明与中等强度持续运动相比，HIIT对肝细胞自噬与凋亡水平的影响起效更快，刺激程度更大，但影响效果并不持久。在两种不同运动方式对肝细胞的影响中，肝细胞自噬与凋亡表现出相互拮抗的关系，肝细胞自噬水平的上调会抑制肝细胞凋亡，改善和保护大鼠肝脏功能。

4 结论

4.1 8周HIIT可有效上调大鼠肝细胞LC3-Ⅱ蛋白表达，下调p62蛋白表达，提高肝细胞自噬水平，相对于传统的中等强度持续运动更为有效。

4.2 8周中等强度持续运动可有效下调大鼠肝细胞Caspase3蛋白表达，下调Bax/Bcl-2比值，降低肝细胞凋亡水平，相对于HIIT更为持续有效。

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