瞿兆蕙,杜 磊,匡 婷,刘洪杰,云永欢,李娟玲,张伟敏,*

(1.海南大学食品学院,海南海口 570228;2.海南省标准化协会,海南海口 570003;3.海南大学热带农林学院,海南海口 570100)

鹧鸪茶(Mallotusoblongifolius(Miq.)Muell-Arg)系大戟科(Euphorbiaceae)、野桐属(Mallotus)植物的干燥叶,又名山苦茶、禾姑茶、毛茶,自古以来是海南民间一种具有浓郁地方和民族特色的代茶饮料植物和重要的药用植物。鹧鸪茶主要分布于海南,零星分布于广东、广西和云南等热带地区,东南亚中印半岛和苏门答腊岛亦有分布[1-2]。传统医学研究表明,鹧鸪茶具有较强的解油腻、助消化、清热消暑和止渴生津等功效[3]。现代药理学也已证实鹧鸪茶具有抗菌、利胆、镇痛、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、增强免疫、抗动脉硬化等功效[4-8],已在海南开发成为具有浓郁地方特色的旅游产品并畅销国内外。

除传统单一茶叶的冲泡形式外,新型复合鹧鸪茶产品逐渐在市场上崭露头角。如陈东良等[9]采用益智干果、鹧鸪茶和白砂糖配比制成益智鹧鸪茶袋泡茶产品。王明强等[10]以鹧鸪茶为主料,辅以杭白菊和柠檬片制作成复合茶粉产品。李翔等[11]以鹧鸪茶、菊花和蜂蜜等为原料开发了澄清鹧鸪茶复合饮料。闫佳等[12]以鹧鸪茶、柠檬酸、蔗糖和蜂蜜为原辅料开发了一款鹧鸪茶营养保健型饮料。任红等[13]以鹧鸪茶、绿茶与杭白菊为原料研制了鹧鸪茶、绿茶、杭白菊复合饮料。初众等[14]开发了速溶鹧鸪茶产品。

目前大部分鹧鸪茶饮料产品的开发主要侧重于产品加工工艺和配方的优化上,很少有关于质量评价与活性分析及活性成分检测方面的系统研究。此外,传统鹧鸪茶饮料开发中甜味剂以蔗糖和蜂蜜为主,饮料产品能量偏高;近年来无糖饮料和低能量饮料风靡当下,且甜菊糖苷被作为一种高甜度低热量的天然甜味剂,具有降血压、降血糖,抗炎抗肿瘤的作用而受到广泛关注,且非常适合作为蔗糖的替代品[15]。特别是以鹧鸪茶、夏枯草为主要原料,辅以薄荷脑和甜菊糖苷作为配料的复合凉茶饮料产品开发研究未见报道。

鉴于此,本文以鹧鸪茶和夏枯草为主要原料,以甜菊糖苷为甜味剂,采用单因素与正交试验相结合方法对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料的配方进行优化,在确定制备工艺和配方基础上,采用国标法对所开发低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料的主要质量指标进行测定,应用分光光度法与HPLC-MS对比分析所开发产品与市售绿茶和凉茶饮料的抗氧化活性、总酚含量及多酚组成,评价本研究所开发产品的质量与品质特性,以便为鹧鸪茶饮料的改良及其他资源的开发利用提供理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鹧鸪茶 产于海南;蔗糖(一级) 广东中轻糖业集团有限公司;柠檬酸(食品级)、薄荷脑、甜菊糖苷(食品级) 江苏维多股份有限公司;夏枯草 同仁堂药店;市售某品牌凉茶、市售某品牌绿茶 购于南国超市;没食子酸标品(98% HPLC)、Folin-Ciocalten试剂、1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH)(分析纯)、ABTS(分析纯) Sigma公司。

754NPC 紫外可见分光光度计 上海奥谱勒仪器有限公司;Z-5000原子吸收分光光度计 日本日立公司;ContrAA300连续光谱原子吸收光谱仪与NovAA400火焰-石墨炉原子吸收光谱仪 德国耶拿分析仪器股份有限公司;AFS230a双光道原子荧光光谱仪 北京海光仪器有限公司;Waters ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色谱 沃特世科技(上海)有限公司;Waters Xevo TQ-S Micro 三重四极杆质谱 沃特世科技(上海)有限公司;Acquity UPLC PDA检测器 沃特世科技(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 不同鹧鸪茶与夏枯草配比对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官品质的影响 以低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官评分为标准,对鹧鸪茶与夏枯草配比进行筛选,在甜菊糖苷添加量0.008%,蔗糖添加量为 5%、柠檬酸添加量为 0.05%时,按照鹧鸪茶与夏枯草配比9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5,依据1.2.1所描述方法制备成产品,研究不同的鹧鸪茶与夏枯草比例对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料饮料感官品质的影响。

1.2.2.2 不同蔗糖添加量对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官品质的影响 以低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官评分为标准,对蔗糖添加量进行确定,在甜菊糖苷添加量0.008%,鹧鸪茶与夏枯草配比为8∶2、柠檬酸添加量为 0.05%时,按照蔗糖添加量为4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%,依据1.2.1所描述方法制备成产品,研究不同的蔗糖添加量对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料饮料感官品质的影响。

1.2.2.3 不同甜菊糖苷添加量对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官品质的影响 以低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官评分为标准,对甜菊糖苷添加量进行确定,在鹧鸪茶与夏枯草配比为8∶2、柠檬酸添加量为 0.05%时,蔗糖添加量为4.5%,按照甜菊糖苷添加量为0.004%、0.008%、0.012%、0.016%、0.020%,依据1.2.1所描述方法制备成产品,研究不同的甜菊糖苷添加量对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官品质的影响。

1.2.2.4 不同柠檬酸添加量对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官品质的影响 以低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官评分为标准,对柠檬酸添加量进行筛选,在鹧鸪茶与夏枯草配比为8∶2、蔗糖添加量为4.5%,甜菊糖苷添加量0.008%,按照柠檬酸添加量为0.025%、0.030%、0.035%、0.040%、0.045%,依据1.2.1所描述方法制备成产品,研究不同的柠檬酸添加量对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料饮料感官品质的影响。

1.2.3 正交试验 根据单因素试验的结果,确定了鹧鸪茶与夏枯草配比、蔗糖添、甜菊糖苷和柠檬酸添加量4因子的最佳因素,分别为鹧鸪茶夏枯草比例8∶2,蔗糖添加量4.5%,甜菊糖苷添加量0.008%和柠檬酸添加量0.040%。采用正交试验设计,对鹧鸪茶与夏枯草配比、蔗糖、柠檬酸和甜菊糖苷添加量按L9(34)进行优选,其因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 感官评定 由20名经过简单培训的食品本科生(上过食品感官鉴评课)组成评定小组对本实验所开发的低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料样品进行三次品尝,每位评员按感官评定标准对其从色泽、口感、气味和组织状态四方面对其进行评分,取平均值,以便得到最佳配方。低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料的评分标准见表2。

表2 低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standard of partridge low energy composite herbal tea beverage

1.2.4 海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料质量评价 海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料主要质量指标按照 《食品安全国家标准饮料》(GB 7101-2015)[16]进行检测。

蠕变作为重要的岩石流变力学特性之一，与岩体工程的长期稳定性紧密相关。在巷道开挖过程中往往会产生一定范围的破裂区，该范围内的破裂围岩在支护的作用下表现为长期蠕变，破裂围岩蠕变是导致巷道长期变形的一个主要因素[1-3]。因此，研究破裂围岩蠕变失稳特性，对巷道围岩稳定性分析和控制有着十分重要的理论意义和实际意义。

1.2.5 海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料总酚、总黄酮和抗氧化活性分析

1.2.5.1 海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料中总酚与总黄酮含量的测定 海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料中总酚(Folin-Ciocalten法)与总黄酮含量(硝酸铝比色法)含量的测定分别参照高玉萍等[17]和谢达平[18]的方法。

1.2.5.2 海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料抗氧化活性的评价 海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料对ABTS自由基清除能力的测定参考Re等[19]的方法。海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料对DPPH自由基清除能力的试验参照Hanato等[20]的方法,海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料还原能力的测定参照Oyaizu等[21]的方法。

1.2.6 多酚组成的测定(UPLC-MS/MS法) 海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料与市售绿茶和凉茶饮料中多酚组成的分析参照李晓彤等[6]的方法略有修改。具体如下:

色谱条件:鹧鸪茶饮料过0.22 μm 滤膜后,由自动进样器进样10 μL,流速0.3 mL/min,柱温35 ℃,采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,5 μm)。流动相为0.25%甲酸(A)水溶液和0.25%甲酸甲醇溶液(B)。洗脱条件:采用梯度洗脱。以流动相B 的含量来表示为:0～3 min,5%;3～10 min,5%～25%;10～16 min,25%～50%;16～20 min,50%～70%;20～24 min,70%～100%;24～16 min,100%;27～30 min,100～110 min,5%。化合物用二极管阵列检测器(PDA)在200～500 nm连续扫描。

质谱扫描条件:ESI+模式:喷雾电压3.0 kV;锥孔电压30 V;脱溶剂温度400 ℃;脱溶剂气(N2)1000 L/h;扫描范围:100～2000 m/z;ESI-模式:喷雾电压0.5 kV;锥孔电压30 V;脱溶剂温度400 ℃;脱溶剂气(N2)1000 L/h;扫描范围:100～2000 m/z。

1.3 数据处理

实验结果重复三次,结果采用平均数±标准差表示。采用Excel 2007,Origin 8.0及GraphPad Prism 5.0软件对数据进行分析及作图处理。采用SPSS 12.0软件(SPSS公司,芝加哥,美国)进行显著差异性分析,p<0.05表示差异显著,p>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料配方的确定

2.1.1 单因素实验 不同影响因素对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官品质影响结果见图1。由图1(A)可知,当鹧鸪茶与夏枯草配比为8∶2 (g/g)时,低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料的感官评分最高,所以选择鹧鸪茶与夏枯草的适宜配比为8∶2 (g/g),由图1(B)可知,当蔗糖添加量为4.5%时,低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料的感官评分最高所以确定蔗糖的适宜添加量为4.5%;由图1(C)可知,当甜菊糖苷添加量为0.008%时,低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料的感官评分最高,因而确定甜菊糖苷的适宜添加量为0.008%;由图1(D)可知,当柠檬酸添加量为0.040%时,低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料的感官评分最高,产品呈现的甜酸比最佳,所以确定柠檬酸的适宜添加量为0.040%。

图1 不同影响因素对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官品质影响

2.1.2 正交试验结果 低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料配方正交试验结果见表3。由表3极差分析可知,不同影响因素对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官品质影响程度由大到小依次为C>B>A>D,即柠檬酸添加量>蔗糖添加量>鹧鸪茶夏枯草配比>甜菊糖苷添加量。说明在综合评定中,鹧鸪茶夏枯草配比对鹧鸪茶夏枯草复合饮料感官品质影响最大,而甜菊糖苷添加量对鹧鸪茶夏枯草复合饮料感官品质影响最小,由此可以得出甜菊糖苷添加不仅能够可以降低蔗糖的添加量,且不会对产品感官品质带来不利的影响。在此基础上可得到低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料的最佳配方为A3B1C1D3。经验证,按照A3B1C1D3所得海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料感官评分39.8,海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料最佳配方为:鹧鸪茶夏枯草配比9∶1 (g/g),蔗糖添加量4.0%,甜菊糖苷添加量0.010%,柠檬酸添加量为0.035%。而且按照实验最佳配方所制备的海南低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料呈淡淡的金黄色,酸甜适中,口感协调柔和,香气淡雅。

表3 正交试验结果Table 3 Results of orthogonal experiment

2.2 低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料质量指标检测结果

按照《食品安全国家标准饮料》(GB 7101-2015)分别对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料质量进行分析测定,依据该国家标准,其中污染物应符合GB-2762的规定,农药残留限量应符合GB-2763的规定,致病菌限量应符合GB-29921的规定等[16]。具体检测结果如下:

2.2.1 主要理化指标测定结果 低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料主要理化指标检测结果见表4,由表4,可知,本实验开发的低能量鹧鸪茶复合凉茶饮料的主要理化指标符合《食品安全国家标准饮料》(GB 7101-2015)的标准,标准中所列的的重金属类和农残类均未检出。

表4 低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料主要理化指标测定结果Table 4 Determination of main physicochemical indexes of partridge low energy composite herbal tea beverage

2.2.2 微生物指标检测结果 低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料主要理化指标检测结果见表5,由表5可知,本实验开发的低能量鹧鸪茶复合饮料的主要微生物指标符合《食品安全国家标准饮料》(GB 7101-2015)标准,其中检测的细菌总数(n=5)均未超过该标准规定的最大限量值100,大肠杆菌(n=5)和霉菌皆小于1,致病菌未检出。

表5 低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料微生物指标检测结果Table 5 Determination of microbiological indexes of partridge low energy composite herbal tea beverage

综合低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料质量指标检测结果分析可知,本实验所开发的低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料理化指标和微生物指标经检验均符合《食品安全国家标准饮料》(GB 7101-2015)标准要求,表明低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料的质量合格。

2.3 低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料总酚和抗氧化活性测定结果

低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料与市售绿茶和凉茶饮料中总酚含量的测定结果见表6,由表6可知,市售绿茶总酚含量最高,而市售凉茶与低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料两者总酚含量并无显著性差异,相差不大;总黄酮含量市售绿茶和市售凉茶远远高于鹧鸪茶。

表6 低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料与市售绿茶和凉茶总酚与抗氧化活性测定结果Table 6 Determination of total phenol and antioxidant activities of partridge low energy composite herbal tea beverage and green tea and herbal tea beverage

通过比较分析低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料与市售绿茶和凉茶饮料抗氧化活性测定结果发现,低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料、市售绿茶和凉茶饮料对DPPH自由基清除能力大小相当于总黄酮当量值(以总黄酮计,EC50越小表明抗氧化活性越好,即同等饮料用量体积抗氧化活性相当于总黄酮的量更大),分别为2.087、1.0670和0.259,表明低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料对DPPH自由基清除能力低于市售绿茶、市售凉茶。低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料、市售绿茶和凉茶饮料对ABTS自由基清除能力大小相当于总黄酮当量值分别为1.445、0.051和0.030,表明低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料对ABTS自由基的清除能力低于市售绿茶和市售凉茶饮料。低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料、市售绿茶和凉茶饮料还原力测定结果发现,市售绿茶和凉茶饮料的还原力相当,并高于低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料。综上可以得出,低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料对DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力低于市售绿茶和凉茶,还原能力也稍弱于市售其他两种茶品饮料。

2.4 多酚组成测定结果

采用UPLC-MS/MS法对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料与市售绿茶和凉茶饮料中多酚组成的测定结果见表7和图2,由图2和表7可知,通过UPLC-MS/MS分析,结合Mass 数据、软件数据库及相关文献对总离子流图主要分子离子峰进行归属,分别从三种茶饮料产品中共鉴定出21个酚类成分,其中隐绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、芦丁、水杨酸和柚皮素6种酚类物质为三者所共有。课题组前期研究发现利用UPLC-MS/MS从抗氧化活性较好的鹧鸪茶70%乙醇提取物中得到7个酚类物质,其中3个酚类物质被鉴定为阿魏酸甲酯、没食子酸和槲皮素[6]。而本实验从鹧鸪茶复合凉茶饮料中并没有课题组原来报道的阿魏酸甲酯、没食子酸和槲皮素成分这可能与鹧鸪茶提取溶剂和杀菌等加工过程对其酚类物质影响有关。此外,与市售凉茶饮料相比,低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料特有鞣花酸;与市售绿茶饮料相比,低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料特有金丝桃苷,而低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料中所含有的金丝桃苷物质则可能与鹧鸪茶复合饮料中的原料夏枯草有关。据余凡等[22]报道,夏枯草中除含有芦丁、橙皮苷、芸香苷、金丝桃苷外,还有3个黄酮素化合物:木樨草素、异荭草素和木犀草甙。另有报道其还含有槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚 3-O-β-D-葡萄糖苷[23-24]。至于隐绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、鞣花酸来源哪种原料有待于进一步确定。

图2 不同饮料产品UPLC-MS/MS总离子图

表7 多酚组成测定结果Table 7 Determination of polyphenol composition

3 结论

通过本实验确定低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料最佳工艺配方为:鹧鸪茶与夏枯草配比9∶1 (g/g),在提取液中分别添加:4.0%蔗糖、0.035%柠檬酸、0.010%甜菊糖苷。经该制备工艺所得产品颜色清澈透亮,呈淡淡的金黄色,酸甜适宜,口感协调,且符合《食品安全国家标准饮料》(GB 7101-2015)质量要求。

此外,通过比较分析低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料与市售绿茶和凉茶饮料抗氧化活性测定结果发现,低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料表现出了一定的清除DPPH、ABTS自由基能力和还原力。通过采用UPLC-MS/MS法对低能量复合鹧鸪茶凉茶饮料与市售绿茶和凉茶饮料中的总酚含量与多酚组成分析发现,隐绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、芦丁、水杨酸和柚皮素6种酚类物质为三者所共有。其中隐绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、水杨酸、柚皮素、金丝桃苷、鞣花酸和芦丁这8种物质为从鹧鸪茶产品中分析发现。下一步实验可以选择对其具体的酚类物质的含量进行进一步定量分析。