王一珍，贺建东2，韩冲芳2，郭大鹏，王志豪

作为一种使用安全、有效性稳定的吸入性麻醉剂，七氟醚自诞生以来逐渐成为日常麻醉工作中重要的麻醉药物[1]。研究证实七氟醚具有一定程度的心肌保护作用，而其中的作用机制尚未明确[2]。自噬是机体清除受损细胞器、维持内环境稳定的机制，大量研究已证实自噬参与心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia and reperfusion injury，MIRI)的各个阶段[3]。动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)是位于细胞质中介导细胞分裂的蛋白，被证实具有介导自噬并保护心肌的作用[4]。由此假设七氟醚对大鼠MIRI的保护作用与Drp1及自噬有关，本实验拟通过建立大鼠MIRI模型，给予七氟醚后处理并测定相关心肌损伤指标及蛋白表达，探究Drp1和自噬在七氟醚后处理大鼠心肌保护中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 本实验动物由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，健康成年雄性SD大鼠45只，体重200～230 g，以随机数字表法分为假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)和七氟醚后处理组(SpostC组)，各15只。所有实验操作均已获得山西医科大学动物伦理委员会许可。

1.2 心肌缺血再灌注实验模型制备 45只大鼠由20%乌拉坦以0.6 mL/100 g麻醉后固定于无菌保温操作台，四肢连接针状电极，由BL NewCentury机能实验系统记录其心率(HR)、心电图(ECG)。颈正中切口入路行气管切开术，连接小型动物呼吸机(成都泰盟软件有限公司，型号HX-101E)，调整呼吸参数为频率60次/min，潮气量2～3 mL/100 g，吸呼比1∶2，氧流量1 L/min，七氟醚挥发罐一端与氧气管连接，一端与动物呼吸机连接，待生命体征稳定后开始实验。采用文献[5]方法制备大鼠MIRI模型，于大鼠胸骨左缘心尖搏动最强处剪开胸骨暴露心脏，以7-0带针缝线沿左心耳下方找到冠状动脉左前降支(LAD)穿过，稳定15 min后开始实验。Sham组仅于LAD下穿线而不结扎，观察150 min；I/R组在LAD下穿过缝线后，在缝线末端穿过聚乙烯导管，拉紧缝线结扎LAD，以结扎部位以下心肌发白，ECG示ST段抬高为缺血模型成功，30 min后松开扎线，以苍白部位转红、ST段下移为再灌注成功，观察120 min；SpostC组于再灌注前吸入2.5%七氟醚5 min后进行再灌注，观察120 min。

1.3 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)法测量心肌梗死面积 每组5只大鼠于再灌注结束后再次结扎冠状动脉，于右颈内静脉注入伊文氏蓝染液1 mL，观察大鼠口唇和四肢蓝染2 min后取下心脏，洗净血液，于-20 ℃短暂冰冻20 min后取出，垂直于心脏长轴将心脏均匀切成2 mm左右切片，经过TTC染色、固定后制成切片，图像经扫描后由ImageJ软件进行分析计算，蓝色为非缺血区，红色为缺血危险区，灰白色为坏死区。计算心肌梗死面积(infraction size，IS)值，IS=心肌梗死区占总截面百分比/危险区占总截面百分比。

1.4 Drp1及微血管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)蛋白表达测定(Western-blot法) 余10只大鼠于再灌注结束后迅速在冰上称取心肌心尖部组织，以清洁剪刀将组织剪碎，并将其放入裂解液，经过裂解、离心后取上清液，按照BCA蛋白检测试剂(Thermo Scientific，23225)说明进行蛋白质浓度检测，计算上样量，随后进行蛋白电泳、转模、孵育，后加入一抗Drp1多克隆抗体(1∶1 000，ABclonal，A2470)和LC3B-兔多克隆抗体(1∶1 000，proteintech，18725-1-AP)4 ℃孵育过夜、漂洗，后孵育HRP山羊抗兔二抗(1∶2 000，ABclonal，AS014)并漂洗。最后进行显影、定影、成像。使用ImageJ量化图像，并使用Photoshop处理图像，得到经典WB条带形式。

1.5 病理切片染色形态学观察 取下蛋白检测材料同时再取部分心尖部组织，用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)经过多聚甲醛固定、乙醇脱水、石蜡包埋、切片等一系列加工后将其制成切片，并将适量中性树胶封固切片，标记后用光学显微镜观察心肌细胞形态学，明确心肌细胞凋亡及损伤程度。

2 结 果

2.1 3组大鼠心肌梗死面积比较 与Sham组比较，I/R组和SpostC组大鼠心肌梗死面积均增大(P<0.01)；与I/R组比较，SpostC组大鼠心肌梗死面积减少(P<0.05)。详见表1。

组别只数 IS值 Sham组50.1±0.5I/R组537.0±1.21)SpostC组526.3±2.61)2)

与Sham组比较，1)P<0.01；与I/R组比较，2)P<0.05

2.2 3组大鼠Drp1、LC3-Ⅱ蛋白表达水平比较 I/R组与SpostC组Drp1、LC3-Ⅱ表达水平较Sham组升高(P<0.05)；与I/R组比较，SpostC组Drp1、LC3-Ⅱ表达水平明显下降(P<0.05)。详见表2。

组别只数Drp1LC3-ⅡSham组 100.47±0.07 0.27±0.04 I/R组100.78±0.071)0.62±0.061)SpostC组 100.58±0.061)2)0.46±0.061)2)

与Sham组比较，1)P<0.05；与I/R组比较，2)P<0.05

2.3 心肌HE染色结果 光镜下可见Sham组心肌细胞形态正常，心肌纤维排列整齐，染色较均匀，细胞核居中；I/R组心肌细胞形态改变，心肌纤维排列紊乱，可见部分纤维断裂，细胞核破坏，可见较多炎性细胞，染色不均匀；与I/R组比较，SpostC组心肌细胞形态较正常，心肌纤维排列较整齐，可见细胞质轻度破坏，胞核相对完整，炎性细胞减少。详见图1。

图1 3组大鼠心肌细胞HE染色结果(×400)

3 讨 论

本实验参照文献[5]的方法，以结扎大鼠心肌冠状动脉左前降支30 min，放松120 min的方法制备心肌缺血再灌注损伤模型。研究结果显示，I/R组在结扎后出现心电图ST段抬高、结扎部位以下区域变白，并于松开扎线后ST段下移，苍白区域变红，120 min再灌注后心肌发生梗死，主要表现为IS值的增大及病理染色心肌细胞形态的变化，提示心肌缺血再灌注模型建立成功。

自噬主要由Beclin-1-Vps34和mTORC1两条通路介导，整个自噬过程分为自噬发动、自噬小泡形成、自噬体膜延伸、自噬体融合和降解、自噬终止5个过程[6]。而LC3-Ⅰ位于细胞质中，在自噬发动后，在自噬相关蛋白7(Atg7)和自噬相关蛋白5(Atg5)的作用下形成LC3-Ⅱ，参与自噬体膜的融合延伸，LC3-Ⅱ的增加(或同时伴LC3-Ⅰ的减少)是自噬表达上调的典型标志[7]。Drp1作为代表细胞分裂的蛋白，同时被发现具有介导自噬的作用[4]。本研究发现，Sham组存在Drp1及LC3-Ⅱ蛋白低水平的表达，表明在正常心肌细胞代谢过程中存在一定程度的细胞分裂和自噬，其存在可能与维持细胞正常能量代谢有关[8]。

自噬在心肌缺血再灌注过程中的作用是一个变化的过程，在心肌缺血阶段，一定程度的自噬可保护心肌免于缺氧损伤，而再灌注过程中，过度上调的自噬加速了心肌细胞的死亡[9-10]。本实验发现I/R组心肌LC3-Ⅱ及Drp1表达均上调，心肌细胞IS值增大且病理染色出现损伤变化，表明再灌注期间Drp1及自噬表达上调，对心肌细胞造成损害。当给予七氟醚后处理后，Drp1及LC3-Ⅱ蛋白表达水平下降，提示心肌细胞分裂及自噬下调，且心肌细胞损伤程度减轻，表现在IS值下降及病理HE染色改变，提示七氟醚后处理能够减轻MIRI，同时下调Drp1及LC3-Ⅱ的表达，减轻心肌细胞自噬，进一步提示Drp1及自噬在七氟醚后处理心肌保护中具有重要作用。

本实验为在体实验，无法排除在体神经、体液等复杂因素对实验结果的影响，应进一步进行离体实验进行探究；随着对细胞分裂及自噬的进一步深入研究，应行细胞培养及相关基因敲除实验，进一步探究七氟醚心肌保护的细胞机制，更加深入了解其相关信号蛋白转导通路。