曹 华，冯美果，侯 帅，滕金艳

(1.咸宁市中心医院，湖北 咸宁 437100；2.湖北省中医院，湖北 武汉 430061)

围绝经期(perimenopausal period)是指女性从绝经过渡期至绝经后1年，出现与绝经相关的潮热汗出、情绪改变、记忆力减退、睡眠障碍等临床特征的期间[1]。其中，失眠是围绝经期女性寻求治疗的核心症状之一[2]。研究显示，中医学防治失眠具有良好的疗效，尤其是利用中医外治疗法之一的针灸治疗围绝经期失眠(Menopause Insomnia，MI)更是近年来关注的焦点之一。其配穴及方法多样，在临床上发挥着较大的优势[3-5]。因此，深度挖掘中医理论防治MI，提高针灸对MI的疗效，对于阐明针灸治疗围绝经期失眠的作用机理有着重要的价值。本研究选择电针三阴交治疗MI，观察电针三阴交对MI模型大鼠睡眠时相及海马区5-HT、5-HIAA、5-HT1A受体水平和5-HIAA/5-HT比值的影响，探讨电针治疗围绝经期失眠可能的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

选取12月龄清洁级(CL)Sprague Dawley(SD)雌性大鼠36只，体质量(300±20)g，由长沙天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2014-0011，饲养于清洁级动物房，温度保持在(24±3)℃，湿度40%～60%左右。普通饲料正常饲养，自由摄食饮水，光照12 h/12 h明暗交替。

1.2 主要仪器和试剂

“华佗牌”针灸针(苏州医疗用品有限公司，0.35 mm×25 mm)；G6805型电针治疗仪(上海医用电子仪器厂)；16道生理记录仪(美国Biopac公司)；大鼠脑立体定位仪(美国Stoelting 公司产品)；生理电刺激仪(上海艾研生物科技有限公司)；Elisa 试剂盒(R&D Systems，Inc，批号: 20180501A)

2 实验方法

2.1 分组方法及卵巢摘除

大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组、模型组和电针组，每组12只。模型组和电针组依照文献方法[6]摘除双侧卵巢，消毒后，缝合皮肤。假手术组术式相同，但只切除卵巢周围与卵巢等重的脂肪组织，不摘除卵巢。各组术后恢复15天，自术后恢复3天起，大鼠逐只检查阴道涂片，连续5天，以不出现角化细胞为卵巢摘除成功。

2.2 脑电肌电电极埋置术

待卵巢摘除手术恢复后，各组大鼠用40 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定于脑立体定位仪上依照文献方法[7]进行大鼠脑内微电极植入手术，并于术后恢复15天。

2.3 成模标准

待电极手术恢复后，将模型组和电针组大鼠放置于失眠刺激器中，通过底部电栅间歇性电刺激大鼠足底部8 h。同时记录大鼠脑电图和肌电图(8:00—16:00间进行连续记录8 h)。刺激参数:频率1 Hz，波宽15 ms，电流0.5 mA，每隔30 min刺激30 s。其中快速眼球运动睡眠(Rapid eyes movement sleep，REMS)、漫波睡眠浅睡期(Slow wave sleep，SWS1)和慢波睡眠深睡期(Slow wave sleep，SWS2) 均减少，表明模型复制成功。

2.4 干预方法

电针组造模完成第1天开始电针三阴交穴治疗，1次/天，连续14天，取穴定位参照李忠仁主编《实验针灸学》，三阴交位于后肢内踝尖直上10 mm。选用0.35 mm×25 mm毫针，直刺4～5 mm，电针治疗仪施以密波，频率为50 r/s，刺激强度以大鼠针刺穴位局部肌肉可见轻微抽搐、大鼠保持安静为度，治疗20 min。于末次治疗30 min后，将大鼠置于失眠刺激器内，记录在电刺激的8 h内脑电图和肌电图(8:00—16:00间进行连续记录8 h) 。

2.5 观察指标

分别观察各组大鼠脑电图变化情况，主要项目为睡眠时相中SWS1、SWS2和REMS等各期时长。待各组脑电实验结束后，将实验大鼠断头取脑，在冰浴上分离大鼠海马区，在分析天平中精密称重后，加入9倍量的生理盐水在冰浴中匀浆，将匀浆液在离心机上离心，3 000 r/min，离心10 min，分离上层血清，置于低温冰箱中保存。严格按照酶联免疫试剂盒说明书采用双抗体夹心法测定各组海马区5-HT、5-HIAA、5-HT1A受体的水平，并计算5-HIAA/5-HT比值。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠睡眠各时相持续时间的变化比较

表1 各组大鼠睡眠各时相持续时间的变化比较

注：与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

由表1结果显示，与假手术组比较，模型组 SWS1、SWS2和REMS均明显缩短(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，电针组可延长电刺激围绝经期大鼠的REMS、SWS1时间(P<0.05或P<0.01)，SWS2有延长的趋势，但无统计学意义(P>0.05) 。

3.2 各组大鼠海马区5-HT、5-HIAA、5-HT1A受体水平和5-HIAA/5-HT比值比较

由表2可知，与假手术组相比，模型组大鼠海马区5-HT、5-HIAA、5-HT1A受体水平明显降低(P<0.05)，5-HIAA/5-HT比值明显升高(P<0.05)；与模型组相比，电针组大鼠海马区5-HT、5-HT1A受体水平显著升高(P<0.05)，5-HIAA/5-HT比值明显降低(P<0.05)，5-HIAA虽然有升高的趋势，但无统计学差异(P>0.05)。

组别n5-HT(ng/mL)5-HIAA(pg/mL)5-HIAA/5-HT5-HT1A(ng/mL)假手术组1273.47±24.7910.83±0.790.17±0.0814.13±0.99模型组1212.39±4.52∗6.53±1.24∗0.58±0.20∗9.15±1.01∗电针组1220.12±5.44#8.12±1.440.39±0.16#13.12±1.44#

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。

4 讨论

围绝经期是女性由中年到老年的过度时期，通常会伴随潮热、心悸、食欲下降、睡眠障碍等症状表现，严重的甚至会出现烦躁、焦虑、抑郁等不良心理情绪，给患者身心带来重大痛苦，影响生活质量[8]，其中有关围绝经期失眠是女性寻求治疗的核心症状之一，由于机制不清，目前西医治疗MI尚无特殊的治疗方法，多以镇静催眠药为主，这类药物虽然能使MI患者的失眠症状得到缓解，但这种缓解是暂时的，且疗效也不确定，久服耐药[9]。因此需要深入研究，探讨其致病机理，寻找新的治疗方法。

基础研究表明，通常使用卵巢切除术(Ovariectomy，OVX)模型研究睡眠[10]，近年来国内研究者客观细致的记录了OVX小鼠模型的睡眠情况[11-12]。并在OVX的基础上合并电刺激，造成动物神经紧张进而产生失眠的症状。对脑内神经递质的研究表明，围绝经期失眠可能与大脑单胺类神经递质5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺等有密切关系[13]，其中5-HT在中枢神经系统中的分布十分广泛, 参与了各种精神活动的调节，被认为可以触发睡眠[14]，而5-HIAA又是5-HT最主要的代谢产物[15]。有研究表明，同一脑区5-HIAA/5-HT的比值反应了这一脑区5-HT神经系统的活跃程度[16]。而在脑内5-HT受体亚型的研究方面，发现广泛分布在海马、杏仁核、侧间脑与脑皮层边缘脑区的5-HT1A 受体与睡眠关系密切。有研究表明，适当增加脑内5-HT1A 受体激动剂(8-OHDPAT)可延长NREMS包括SWS、减少清醒，对REMS无明显影响，而大剂量则抑制睡眠(包括REMS和SWS)、促进清醒[17]。

中医学并无“围绝经期失眠”之病名，但根据临床观察MI最常见的失眠症状仍属于入睡难、早醒、通宵难眠、多梦、易惊等范畴。其病机多为心脾两虚证、心胆气虚证、肝郁脾虚证、脾肾阳虚证、肾虚肝郁证、肾阴阳两虚证等。中医药对于治疗MI具有较好的疗效，其针灸因其历史悠久、配穴方法多样、副作用小在临床上发挥较大的优势，成为近年来治疗围绝经期失眠关注的焦点之一。三阴交是人体重要穴位，是十总穴之一，为足太阴脾经、足少阴肾经、足厥阴肝经交会之处，具有健脾益血、调肝补肾的功效，临床上常用于治疗月经不调、更年期综合症等，此外此穴还具有安神的功能，如《针灸甲乙经》说:“三阴交主足下热痛，不能久坐，湿痹不能行，惊不得眠。”，研究表明针灸三阴交对于治疗肝气郁结、肝血不足、痰湿中阻等失眠疗效确切[18-19]，且明代李言闻删补改订本《四言举要》云:“妇人之脉，以血为本”，可见治疗绝经期失眠取穴应以疏肝养血的穴位为准。

综上，本研究通过观察电针三阴交对OVX失眠模型大鼠睡眠时相以及海马区5-HT、5-HIAA、5-HT1A受体水平和5-HIAA/5-HT比值，探讨其治疗围绝经期失眠可能的作用机制。研究发现，OVX失眠模型大鼠的SWS1、SWS2和REMS均明显缩短，表明模型复制成功，大鼠处于围绝经期失眠。电针大鼠三阴交穴可明显延长OVX失眠模型大鼠REMS、SWS1期的睡眠时间，表明电针三阴交穴能够改善大鼠围绝经期失眠，其作用机制可能与增加海马区5-HT、5-HIAA和5-HT1A受体含量、降低5-HIAA/5-HT比值有关。