丹防胶囊对免疫性肝纤维化大鼠肝组织wnt1、β-catenin、DKK1表达的影响

2019-08-24李璨陆爽吴君

天津医药 2019年8期

李璨，陆爽，吴君

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是肝组织受多种自身或外界环境刺激引起慢性炎性损伤后进行的病理性自身修复过程，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化是肝纤维化发生的关键环节［1］。近30年来，国内外学者致力于研究直接作用HSC进行抗肝纤维化的靶点。研究显示，在CCl4或化学毒物所致的肝纤维化模型中，wnt/β-catenin 通路与HSC的活化及肝纤维化形成存在一定的关系［1-2］。Dickkopf-1（DKK1）作为wnt 蛋白的抑制因子，可抑制该通路激活，具有改善组织纤维化的作用［3］，但目前wnt/β-catenin通路在免疫性肝纤维化大鼠模型中的作用机制尚少见报道。免疫性肝纤维化模型常用猪血清进行诱导，该方法经济简捷、肝纤维化形成率高、对动物损伤轻微，且与人类慢性病毒性肝炎导致的肝纤维化在发病机制上接近。复方鳖甲软肝片是目前临床上常用的抗肝纤维化效果较好的一类药物，其机制与抑制HSC增殖，减少胶原合成并沉积于Diss 间隙有关［4］。丹防胶囊是由丹参、黄芪、汉防己、熟大黄、银杏叶、土鳖、鳖甲、龟板及三七组成的复方制剂。本课题组前期研究发现，丹防胶囊对大鼠免疫性肝纤维化有一定的干预作用［5］。因此，本研究采用猪血清诱导建立大鼠免疫性肝纤维化模型，以复方鳖甲软肝片为阳性对照药，检测各组大鼠肝组织wnt1、β-catenin、DKK1 的表达，进一步探讨丹防胶囊对大鼠免疫性肝纤维化干预作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及药物 60 只清洁级雄性SD 大鼠，体质量（200±20）g，由贵州医科大学动物实验中心提供（SYXK 黔2015-0001）；丹防胶囊（贵州省贵阳天阳生物技术有限公司，自制复方制剂未申报为新药）；复方鳖甲软肝片（内蒙古中蒙药科技公司），丹防胶囊和复方鳖甲软肝片均与蒸馏水按1∶10 混合制成溶液给药。本研究获得贵州医科大学伦理委员会批准（1402050）。

1.1.2 主要试剂及仪器无菌猪血清（北京燕生政博公司，141105）；wnt1 抗体（Abcam，ab85060）；β-catenin 抗体（Abcam，ab32572）；DKK1 抗体（Abcam，ab109416）；GAPDH抗体（Cell Signaling，14C10）；山羊抗兔二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZB-2301）；总RNA 提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司，Dp 419］；PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser（TAKARA BIO INC，RR047A）；TB Green premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH plus，TAKARA BIO INC，RR820A）；qPCR引物（武汉天一辉远生物科技有限公司）；羟脯氨酸（HYP）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，A030-2）；SDS-PAGE 微型凝胶电泳及转膜设备（美国BIO-RAD 公司）；ChemiScope5300一体式化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；荧光定量PCR 仪ViiA 7 Dx（Life technologies）；核酸测定仪Nanodrop 2000（Thermo scientific）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及处理 60只清洁级SD大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表法均分为6组：正常组、模型组、阳性药物组、低剂量丹防胶囊组（低丹组）、中剂量丹防胶囊组（中丹组）、高剂量丹防胶囊组（高丹组），每组10 只。除正常组外，其余各组大鼠均腹腔注射无菌猪血清0.5 mL建立大鼠免疫性肝纤维化模型，正常组腹腔注射生理盐水0.5 mL，每周2次。造模同时，低、中、高丹组每天分别给予丹防胶囊0.54、2.16、4.32 g/kg灌胃，阳性药物组给予复方鳖甲软肝片0.54 g/kg灌胃，正常组与模型组给予等量生理盐水灌胃，共12周［5］。第12周初随机处死模型组大鼠2只，行苏木素-伊红（HE）染色，若均符合肝纤维化程度3～4 级病理组织学改变，则显示造模成功。实验第1周，低丹组和中丹组因灌胃操作失误各死亡1只大鼠；实验第5周，模型组因肺部出现出血灶致1只大鼠死亡。12周末行麻醉处死大鼠，取各组大鼠肝右叶相同部位肝组织，一部分肝组织经甲醛固定后石蜡包埋用于HE染色和免疫组织化学染色；剩余新鲜组织置于-80 ℃冰箱保存用于后续实验。

1.2.2 碱水解法检测各组大鼠肝组织HYP 含量取各组大鼠肝右叶相同部位肝组织称湿重，并严格按试剂盒操作要求检测HYP含量。

1.2.3 HE 染色取各组大鼠肝右叶相同部位肝组织，常规石蜡包埋，制作为4 μm厚切片，经二甲苯脱蜡及不同浓度乙醇水化后，行HE染色，40倍光镜下观察肝组织病理学改变。

1.2.4 免疫组化染色检测肝组织wnt1、β-catenin、DKK1蛋白的表达肝组织石蜡包埋后切成4 μm厚的切片，经脱蜡、水化及抗原修复后孵育一抗wnt1（1∶200）、β-catenin（1∶100）、DKK1（1∶100），4 ℃过夜。二抗37 ℃孵育30 min，经DAB 显色、复染、返蓝、中性树胶封片。显微镜下每张切片随机选取4个高倍镜视野（×400）观察定位，以细胞质出现棕黄色染色为wnt1、β-catenin 阳性细胞，细胞核出现棕黄色或褐色染色为DKK1阳性细胞，并利用Image J计算平均光密度（OD）值。

1.2.5 Western blot 检测肝组织wnt1、β-catenin、DKK1 蛋白的表达称取约40 mg 肝组织，加入1 mL 裂解液，采用超声波震碎法置于冰上操作进行匀浆，4 ℃、12 000 r/min 离心5 min，吸取上清移入干净EP管内，运用BCA法测定蛋白浓度，使各管蛋白浓度一致，随后按4∶1 加入5×SDS Loding buffer，100 ℃金属浴加热10 min 变性。蛋白样品每孔上样量约80 μg进行电泳，电泳结束后将蛋白转到PVDF膜，5%脱脂奶粉常温封闭4 h。结束后加入一抗wnt1（1∶1 000）、β-catenin（1∶5 000）、DKK1（1∶2 000）、GAPDH（1∶6 000）4 ℃冰箱孵育过夜。次日加入HRP标记的二抗（1∶5 000），常温孵育50 min，洗膜并曝光，以GAPDH 为内参照，利用Image J 对各组蛋白条带进行灰度值分析。

1.2.6 qPCR 检测肝组织wnt1、β-catenin、DKK1 基因的表达称取约50 mg肝组织，按照总RNA提取试剂盒说明书操作提取总RNA。采用Nanodrop 2000 测定A260/A280并记录RNA 样品的浓度及纯度。采用PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser对RNA样品进行逆转录。按PCR操作说明书在ViiA 7 Dx PCR仪器上进行实时定量PCR操作。PCR反应体系为2 μL 上下游引物混合物（各1 μL）、1.6 μL cDNA、10 μL SYBR、0.4 μL ROX Ⅱ、6 μL ddH2O。反应条件为95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 个循环。以GAPDH 为内参照，每组样本设置3 个复孔，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。引物序列见表1。

Tab.1 Primer sequence of qPCR表1 qPCR引物序列

1.3 统计学方法数据采用SPSS 22.0 统计软件处理，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织HYP 含量比较与正常组比较，模型组及低、中丹组HYP含量增多（P＜0.05）；与模型组比较，低丹组HYP 含量差异无统计学意义（P＞0.05），中、高丹组HYP 含量降低（P＜0.05）；与阳性药物组比较，低、中丹组HYP 含量增多（P＜0.05），高丹组差异无统计学意义（P＞0.05）；低、中、高丹组HYP含量依次降低，组间多重比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1。

Fig.1 HYP contents in liver tissues of rats图1 大鼠肝脏组织HYP含量

2.2 肝组织病理学改变正常组肝组织结构完整清晰，肝组织中未见胶原纤维增生；模型组可见广泛肝组织破坏，肝索排列紊乱，汇管区可见胶原纤维增生，部分区域有假小叶形成；与模型组比较，低丹组肝纤维化程度无明显改善，中、高丹组肝纤维化程度明显减轻；与阳性药物组比较，低、中丹组纤维化程度严重，而高丹组纤维化最轻且与其差异不大；低、中、高丹组中肝纤维化程度逐渐减轻，其中高丹组肝纤维化改善最明显。见图2。

2.3 免疫组化染色检测大鼠肝组织wnt1、βcatenin、DKK1 蛋白的表达 wnt1、β-catenin 定位于细胞质，正常肝组织有少量表达甚至不表达；DKK1定位于细胞核，正常肝组织中大量表达。与正常组比较，模型组及低、中丹组wnt1、β-catenin 蛋白表达水平升高，DKK1蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，中、高丹组wnt1、β-catenin 蛋白表达水平降低，DKK1蛋白表达水平升高（P＜0.05），低丹组差异无统计学意义；与阳性对照组比较，低、中丹组wnt1、β-catenin 蛋白表达水平升高，DKK1蛋白表达水平降低（P＜0.05），高丹组差异无统计学意义；低、中、高丹组wnt1、β-catenin 蛋白表达水平依次降低，DKK1 蛋白表达水平依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2、图3。

2.4 Western blot 检测大鼠肝组织wnt1、β-catenin、DKK1蛋白的表达与正常组比较，模型组及低、中丹组wnt1、β-catenin蛋白表达水平升高，DKK1蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，中、高丹组wnt1、β-catenin 蛋白表达水平降低，DKK1蛋白表达水平升高（P＜0.05），低丹组差异无统计学意义；与阳性药物组比较，低、中丹组wnt1、β-catenin 蛋白表达水平升高，DKK1蛋白表达水平降低（P＜0.05），高丹组差异无统计学意义；低、中、高丹组wnt1、βcatenin 蛋白表达水平依次降低，DKK1 蛋白表达水平依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表3、图4。

Tab.2 Expressions of wnt1,β-catenin and DKK1 in rat liver tissues表2 大鼠肝组织中wnt1、β-catenin、DKK1的表达（OD值，±s）

＊P＜0.05；a 与正常组比较，b 与模型组比较，c 与阳性药物组比较，d与低丹组比较，e与中丹组比较，P＜0.05

组别正常组模型组阳性药物组低丹组中丹组高丹组F n 10 9 10 9 9 1 0 wnt1 15.87±5.38 73.71±5.37a 18.91±2.90 64.99±4.92ac 32.38±5.75abcd 17.60±3.65bde 495.19＊β-catenin 14.75±3.37 42.19±8.81a 17.12±2.54 31.83±8.89ac 18.86±2.32abcd 17.33±2.45bde 9.00＊DKK1 43.49±8.11 18.99±2.26a 33.79±4.05 22.00±1.03ac 29.25±2.09abcd 35.46±4.85bde 10.22＊

Tab.3 The protein expression levels of wnt1,β-catenin and DKK in rat liver表3 大鼠肝组织中wnt1、β-catenin、DKK1的蛋白表达水平（±s）

＊P＜0.05；a 与正常组比较，b 与模型组比较，c 与阳性药物组比较，d与低丹组比较，e与中丹组比较，P＜0.05

组别正常组模型组阳性药物组低丹组中丹组高丹组F n 10 9 10 9 9 1 0 wnt1 0.43±0.12 1.56±0.19a 0.68±0.15 1.22±0.12ac 0.90±0.13abcd 0.51±0.15bde 26.71＊β-catenin 0.63±0.04 1.44±0.18a 0.52±0.15 1.36±0.09ac 0.97±0.13abcd 0.71±0.07bde 22.52＊DKK1 1.48±0.14 0.76±0.24a 1.31±0.11 1.01±0.24ac 1.08±0.18abcd 1.29±0.10bde 6.08＊

Fig.4 Western blot results of protein expressions of wnt1,β-catenin and DKK1 in rat liver tissues图4 Western blot检测大鼠肝组织wnt1、β-catenin、DKK1蛋白表达

2.5 qPCR 检测大鼠肝组织wnt1、β-catenin、DKK1 mRNA的表达与正常组比较，模型组及低、中丹组wnt1、β-catenin mRNA 表达水平升高，DKK1 mRNA表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，中、高丹组wnt1、β-catenin mRNA 表达水平降低，DKK1 mRNA表达水平升高（P＜0.05），低丹组差异无统计学意义；与阳性对照组比较，低、中丹组wnt1、β-catenin mRNA 表达水平升高，DKK1 mRNA 表达水平降低（P＜0.05），高丹组差异无统计学意义；低、中、高丹组wnt1、β-catenin mRNA 表达水平依次降低，DKK1 mRNA 表达水平依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表4。

Tab.4 Expression levels of wnt1,β-catenin and DKK1 mRNA in rat liver表4 大鼠肝组织内wnt1、β-catenin、DKK1 mRNA表达水平（±s）

＊P＜0.05；a 与正常组比较，b 与模型组比较，c 与阳性药物组比较，d与低丹组比较，e与中丹组比较，P＜0.05

组别正常组模型组阳性药物组低丹组中丹组高丹组F n 10 9 10 9 9 1 0 wnt1 mRNA 0.28±0.07 1.00±0.00a 0.39±0.08 0.70±0.17ac 0.58±0.16abcd 0.33±0.08bde 36.49＊β-catenin mRNA 0.40±0.23 1.00±0.00a 0.51±0.06 0.66±0.24ac 0.57±0.14abcd 0.46±0.07bde 11.55＊DKK1 mRNA 2.95±0.30 1.00±0.00a 2.37±0.30 1.35±0.16ac 1.59±0.22abcd 2.59±0.28bde 53.20＊

3 讨论

HSC 作为肝纤维化发生的中心环节，多条信号通路可通过活化HSC 导致肝纤维化的发生。其中，wnt 信号通路与肝纤维化的发生发展存在密切关系［6-8］。有研究表明，在HSC中，通过抑制wnt通路激活可抑制HSC 的活化，起抗肝纤维化的作用［9］。由丹参、黄芪、汉防己、熟大黄、银杏叶、土鳖、鳖甲、龟板及三七组成的丹防胶囊，其包含的药物单方均被证实有较好的抗纤维化效果［10-13］。前期研究发现丹防胶囊可能对大鼠HSC 细胞的增殖有抑制作用［14］。本研究在此基础上，进一步验证丹防胶囊对肝纤维化的干预作用，并探讨其作用机制是否与wnt/βcatenin通路相关。

本研究结果显示，模型组大鼠肝组织实质大部分被破坏，肝细胞排列紊乱，汇管区内有胶原纤维形成，呈条索状向肝小叶放射并破坏肝小叶结构，甚至出现假小叶，HYP含量最高，表明猪血清诱导的大鼠免疫性肝纤维化模型建立成功。与模型组比较，低剂量丹防胶囊组肝纤维化程度及HYP 含量无明显变化，但中、高剂量丹防胶囊组肝纤维化程度及HYP含量明显减轻，其中高剂量丹防胶囊组较中剂量丹防胶囊组变化更明显，提示丹防胶囊对大鼠免疫性肝纤维化有一定的干预作用，并呈剂量相关性。经高剂量丹防胶囊和复方鳖甲软肝片干预后的肝组织，其肝纤维化程度、HYP 含量无明显差异，提示在本实验条件下高剂量丹防胶囊的疗效与复方鳖甲软肝片类似。结合前期研究结果［5］表明，中、高剂量的丹防胶囊可对免疫性肝纤维化起保护作用，但尚需在其他因素（如CCl4、复合因素等）所致的大鼠肝纤维化模型中进一步验证。

Huang 等［15］研究发现在CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型中，模型组wnt1、β-catenin 的表达水平高于正常组，经干预后wnt1、β-catenin 的表达水平下降，wnt/β-catenin 通路激活被抑制，进一步抑制HSC 的活化，减少胶原纤维分泌，达到改善肝纤维化的效果。DKK1是wnt家族的一类抑制因子，在肝、腹膜、胰腺等器官纤维化中均被证实可通过抑制wnt通路改善器官纤维化［16-18］，但目前DKK1 在免疫性肝纤维化中的作用尚少见报道。本研究免疫组化染色结果显示，与模型组相比，低剂量丹防胶囊组wnt1、βcatenin、DKK1 蛋白表达水平无明显差异；然而，中、高剂量丹防胶囊组wnt1、β-catenin 蛋白表达水平降低，DKK1蛋白表达水平升高。Western blot 及qPCR结果显示，wnt1、β-catenin、DKK1蛋白与mRNA表达水平的变化与免疫组化染色结果一致。提示丹防胶囊可以影响wnt/β-catenin通路的表达，本研究认为，丹防胶囊对大鼠免疫性肝纤维化的干预作用可能是通过上调DKK1 表达，降低wnt1、β-catenin 表达，从而影响wnt/β-catenin通路激活有关。同时低剂量丹防胶囊并未激活wnt/β-catenin 通路，这也解释了其未能改善小鼠肝纤维化的原因，亦证实了上述推论。

综上所述，丹防胶囊对大鼠免疫性肝纤维化起保护作用，其机制可能是通过上调DKK1表达，降低wnt1、β-catenin 表达，抑制wnt/β-catenin 通路激活，从而改善大鼠免疫性肝纤维化。本研究证实了wnt/β-catenin 通路与肝纤维化的相关性，进一步探究了丹防胶囊改善肝纤维化可能的潜在机制，为抗肝纤维化治疗提供新的思路和方向。