赵晓敏 郭颖 李姗姗 李雯 崔洪艳 常颖

(天津市中心妇产科医院 产科、天津市人类发育与生殖调控重点实验室，天津，300100)

NIPT(non-invasive prenatal testing, NIPT)，即利用母体外周血中胎儿游离细胞DNA(cell-free fetal DNA，cffDNA)进行大规模平行测序[1, 2]。自从2011年NIPT正式引入临床[3, 4]，其应用价值就备受临床医生和科研人员的关注。随着科学技术的进步，目前NIPT的筛查范围已不仅仅是常见染色体三体(21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征)，还包括性染色体非整倍体、罕见染色体异常以及特定微缺失、微重复综合征的筛查[5]。然而，随着筛查范围的不断扩大，迫切需要大量数据进一步证实其临床可行性[6, 7]。NIPT的准确率受多种因素影响，统一的筛查标准，严格的质控是NIPT应用于临床的重要前提。

随着研究的不断进展，发现染色体亚显微结构的缺失和重复并不少见，有报道指出在常见三体高风险而超声结构正常的胎儿中，有临床意义的微缺失、微重复综合征的发生率为1%～1.7%[8]。 微缺失、微重复综合征在产前较难发现的原因分为以下两点：①产前异常较为微小或者常规的产前超声检查难以发现，目前产前超声异常小于40%是在中期超声筛查中发现，而早期并无结构异常发生；②不同于非整倍体，存在高龄等明确的危险因素。大多数拷贝数变异(copy number variants，CNVs)缺乏明确的危险因素。因此，目前将cffDNA用于微缺失、微重复综合征的筛查对于产前遗传咨询专家和患者来说都面临着巨大的挑战。

本研究的目的是对影响NIPT准确性的相关因素进行分析。明确其适用人群，加强质量管理，进一步提高其阳性预测值。

1 资料与方法

1.1 基本资料 选取2015年1月至2017年11月因胎儿NIPT结果异常(多家检测公司)进一步于天津市中心妇产科医院行羊膜腔穿刺进行产前诊断的病例。纳入标准：①单胎、活胎妊娠；②羊水清亮，无混血；③父母无家族性遗传性疾病、无血液系统传播疾病及先天性免疫缺陷病；④自然受孕，排除促排卵、胚胎移植等辅助生殖技术的妊娠。

1.2 研究方法 收集的数据包括人群的基本信息(身高、体重、 年龄、孕周、孕次、产次)，部分胎儿颈部透明层厚度、NIPT结果和羊膜腔穿刺结果。由于纳入病例NIPT检测公司不同，对于性染色体异常并无统一报告标准，然而NIPT对于不同类型性染色体数目异常的检出率并不相同，因此将NIPT结果分类为：常见染色体三体(21-三体、18-三体、13-三体)高风险、性染色体数目偏多、性染色体数目偏少、性染色体数目异常、罕见染色体异常,将产前诊断结果与产前筛查结果进行对比分析。同时，研究孕妇年龄、身体质量指数(body mass index，BMI)等因素是否影响筛查结果的准确性。

2 结果

2.1 样本分布分析 最终纳入NIPT异常结果病例共441例，人群一般特征见表1。 对441例患者进行羊膜腔穿刺产前诊断并对NIPT和羊膜腔穿刺结果进行分类统计，计算其真阳性(true positive,TP)例数，阳性预测值(positive predictive value, PPV)和假阳性率(false positive rate, FPR)(表2)，本研究对于真阳性例数的纳入标准包括：①筛查结果与产前诊断结果完全相符；②诊断结果为高度嵌合(如：NIPT为13三体，而产前诊断结果为13三体的高度嵌合)；③部分相符：如NIPT结果为13三体，而产前诊断结果为三体中的一部分为13-三体。符合以上任意一项即为真阳性。真阴性病例则为NIPT与产前诊断结果完全不符。NIPT 21-三体高风险、18-三体高风险、13-三体高风险、性染色体数目偏多、性染色体数目偏少、性染色体数目异常、罕见染色体异常纳入例数分别为149例、49例、24例、81例、53例、26例、59例，最终产前诊断确诊的例数分别为116例(78.0%)、22例(45.05%)、5例(21.0%)、54例(67.0%)、9例(17.0%)、9例(35.0%)、7例(12.0%)。

随着NIPT技术水平的不断提高，罕见染色体异常正逐渐被纳入其筛查范围， 本研究中NIPT发现罕见染色体异常59例(染色体数目异常或拷贝数变异)，产前诊断最终证实7例与筛查结果一致，准确率较低，因此NIPT用于罕见染色体异常的筛查仍然需要进一步研究。

2.2 孕妇年龄因素对于筛查结果准确性的影响 为了进一步探讨年龄因素对于筛查结果准确率的影响，将NIPT提示21-三体、18-三体、13-三体以及性染色体异常的441例患者根据年龄分为两组：高龄组(≥35岁)和适龄组(18～34岁)，高龄组139例，羊膜腔穿刺核型分析最终结果39例为46，XN，100 例为染色体非整倍体且与筛查结果相符；适龄组243例，羊膜腔穿刺核型分析最终结果127例为46XN，116例为染色体非整倍体且与筛查结果相符(表3)。统计学分析结果最终P=0(P<0.05)，孕妇年龄与筛查准确率具有统计学意义，说明高龄是影响NIPT准确率的因素之一。此外，两组间孕次、产次统计学分析结果P<0.05，存在统计学差异。因此，对于年龄>35岁的妊娠妇女推荐直接进行产前诊断，本研究统计结果与我国母婴保健法建议相一致。

2.3 孕妇BMI、胎儿颈项透明层厚度对于筛查结果准确性的影响 为了研究孕妇BMI对于产前筛查准确度的影响，我们随机调查了187例孕妇的BMI(其中NIPT结果为常见染色体非整倍体或性染色体非整体的孕妇为105例)，根据BMI分类标准，进行统计(表4)。此外，本研究通过对比胎儿颈项透明层厚度(nuchal translucency, NT)，进一步验证NIPT对于染色体非整倍体筛查的应用价值。441例NIPT异常患者中随机调查了48例患者的早期NT数据，其中6例NT≥3.0mm的患者产前诊断最终证实5例为非整倍体，且与NIPT结果相符，1例为46XN。42例NT小于3.0mm的患者产前诊断最终证实21例为46XN，21例为染色体非整倍体，且与NIPT结果相符(表5)，采用Fisher确切概率进行统计分析，P=0.199(P>0.05)，因此，本研究中48例患者NT值的差异NIPT准确率的影响没有统计学意义。

表1 人群一般特征

表2 cffDNA与产前诊断结果

表3 孕妇年龄与NIPT准确率的关系

注：由于NIPT用于罕见染色体异常的效果尚无确切数据，本表格中数据仅对NIPT提示21-三体高风险、18-三体高风险、13-三体高风险以及性染色体异常的病例进行统计

表4 孕妇BMI对于NIPT准确率的影响

(注：表中数据仅对NIPT提示21-三体高风险、18-三体高风险、13-三体高风险以及性染色体异常的病例进行统计)

表5 48例NIPT高风险患者NT值与产前诊断结果的关系

3 讨论

染色体非整倍体是导致遗传缺陷的主要原因，在活产儿中最常见的染色体非整倍体是21-三体(唐氏综合征)，18-三体(Edwards综合征)、13-三体(Patau综合征)和性染色体非整倍体。大量研究表明，每800例新生儿中就有1例唐氏综合征患儿[9]， 而且随着二孩政策的开放，高龄产妇逐渐增多，染色体非整倍体的发生率逐渐增加，相关研究发现对于一位45岁的妊娠女性，胎儿发生21-三体综合征的概率上升至1/35[10, 11].。 研究表明，NIPT对于21-三体和18-三体的敏感度高于99%，对于13-三体的敏感度为 78.6%～91.7%[12, 13]，而关于性染色体非整倍体敏感度的研究相对较少。本研究再一次验证了NIPT对于21-三体的准确率最高(78.0%)，其次是18-三体(45.0%)，13-三体最低为21.0%。然而相对于大样本研究数据，本研究中21-三体的准确率仍然较低，分析其可能的原因主要为以下几个方面：①NIPT检测公司不同，其准确率不同；②cffDNA的浓度受采血孕周的影响，孕周偏小会导致cffDNA浓度偏低，影响NIPT的准确率，本研究中所纳入病例的采血孕周未知；③孕妇年龄、BMI等也是影响cffDNA浓度以及NIPT准确率的重要因素[14]，例如本研究中1例肥胖Ⅱ级和1例极度肥胖孕妇并不属于进行NIPT的适应证，造成了假阳性的结果。因此，在产前筛查和诊断中应该进一步关注质控问题，减少假阳性和假阴性率的发生，更好地提高NIPT在临床应用中的效力。近来，关于NIPT对于性染色体非整体准确率较低的原因分析备受关注，可能的原因是NIPT筛查的遗传信息即cffDNA，来源于胎盘滋养层细胞而不是真正的胎儿细胞[15]。因此，当存在性染色体的局限性胎盘嵌合时会造成NIPT假阴性或假阳性结果[16]。所以，这也是NIPT筛查相对于传统核型分析的局限性之一。

目前将NIPT用于筛查微缺失、微重复综合征引发热议。不同于非整倍体筛查，大多数常见的微缺失、微重复综合征不受年龄因素影响。有研究认为，NIPT筛查特定的微缺失、微重复综合征可以减少不必要的产前诊断以及减少临床意义不明的CNVs出现，有效降低了遗传咨询的压力，减少患者及家属不必要的焦虑。然而值得提出的是，临床中尚不能提供充足的数据以证明其敏感度、阳性预测值等。本研究中441例NIPT高风险中59例为罕见染色体数目异常或CNVs，产前诊断最终证实7例存在异常且与NIPT结果一致，4例存在异常但与NIPT结果不一致。 NIPT对于罕见染色体异常的准确率较低，与相关文献结论一致[17]。由于本研究中例数较少且CNVs自身发生率较低，因此，尚不能说明NIPT用于这一领域的准确性。此外，相关指南目前尚不推荐将NIPT用于筛查所有CNVs，仅用于特定的CNVs。因此，对于选择NIPT进行微缺失、微重复综合征筛查的孕妇，应告知NIPT技术目前的局限性，以便更好的进行遗传咨询工作。

伴随二孩政策的开放，高龄产妇逐渐增加。本研究中高龄孕妇占总体的35.8%，NIPT高风险的高龄组孕妇与适龄组孕妇发生染色体非整倍体的概率存在统计学差异P=0(P<0.05)。高龄组的染色体非整倍体发生率较适龄组高。因此，本研究认为NIPT对于非整倍体产前筛查有着很大的优势，ACOG指南[18]指出NIPT适用于35岁以上所有孕妇,但是，我国目前尚无相关共识及指南,仍需大数据的积累,同时需考虑其经济成本效益。

总之，相对于传统的筛查方法，NIPT有着更多的优势，而且随着NIPT技术水平的不断提高，其在产前筛查中会有着更加广阔的应用前景。当然，这一技术带来效益的同时，也对临床工作带来了极大的挑战。在临床中应更加注重质控问题，应向患者及家属告知NIPT筛查的局限性以及做好对筛查结果的遗传咨询工作[19]。 NIPT目前仍然主要用于常见染色体非整倍体以及性染色体异常的筛查。对于微缺失、微重复综合征以及罕见染色体异常的筛查有待进一步验证。需要说明的是，本研究例数较少，并且纳入病例来源于多家NIPT检测公司，仍然需要更多的数据进行支持。