李文 莫港澳 孙欣

摘要：以不动杆菌（Acinetobacter indicus）JL-1为菌种，使用无机磷液体培养基测定其解磷性能。采用单因素试验与正交试验确定最佳解磷条件：碳源为10.0 g/L蔗糖，2.0 g/L复合氮源（硫酸铵与酵母粉质量浓度比为1 ∶ 1），pH值为7.5，温度为37 ℃，装液量为50 mL/250 mL。在此最优条件下，解磷量在48 h时最高，为61.02 μg/mL，菌落数为2.69×1011 CFU/mL，发酵过程中pH值呈先下降后略上升的趋势。通过对其解磷机制进行初步研究，确定此菌株以酸解为主、酶解为辅的方式来解磷。

关键词：解磷菌;不动杆菌;正交试验;解磷性能;解磷机制

中图分类号： S182  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）12-0311-05

磷元素是植物成长进程中的一种重要元素[1]，广泛地参加植物细胞内多种生理生化进程，能够显著有效地促进植物生长发育和新陈代谢过程[2]。我国大约有74%的耕地缺磷，并且土壤中的绝大部分磷是无效磷，植物难以吸收使用[3-4]，而施用磷肥又会对环境和经济造成不良的影响[5]。土壤中存在大量的解磷菌，包括细菌、放线菌和酵母菌，它们能将难溶性的磷转化为农作物可吸收利用的可溶性磷，促进农作物生长，改善土壤环境，显著提高土壤中的有效磷含量，因此，解磷菌的研究与应用对于农业生产具有重要的理论和实践意义，有助于缓解我国土壤磷素缺乏和环境污染问题。

影响解磷微生物解磷性能一方面是由于解磷微生物自身的遗传特性差异，除此之外，诸多物理化学因素也对解磷微生物分解磷化合物产生重要影响，例如土壤中磷素的种类和含量、酸碱度、温度、土壤成分等因素。解磷微生物获得的碳、氮营养通过影响微生物的生长和代谢过程，也可以影响微生物对土壤中磷化合物的分解。许多学者通过对解磷菌株在多种碳氮源下的解磷能力进行测定，考察能量来源对微生物解磷效应影响的大小，并寻找最优碳氮源。赵小蓉等研究了解磷微生物培养基中碳源、氮源以及碳氮比对于解磷微生物解磷的影响，认为解磷微生物生长代谢受碳源、氮源以及碳氮比影响，其中突出表现为解磷菌代谢产生的有机酸受此影响很大[6]。

解磷菌的解磷过程是个复杂的过程，解磷机制比较复杂，解磷能力也表现出差异。有些微生物在土壤缺磷的情况下，向外分泌植酸酶、核酸酶、磷酸酶等，将无效磷转化为有效形式[7-8]。还有些微生物解磷与其产生的有机酸有关，这些有机酸能够降低pH值，与铁、铝、钙、镁等离子结合，从而使难溶性的磷酸盐溶解[9-11]。而有些菌株这2种机制都存在，在其解磷过程中共同作用，从而导致难溶磷的溶解[12]。每种解磷微生物解磷的方式各不相同，具有明显的特异性。

本研究对前期筛选所得的不动杆菌JL-1进行解磷性能初步测定，通过对培养基及条件进行优化以提高解磷菌的解磷性能，继而初步探究其解磷机制，以期为利用此解磷菌用于微生物肥料生产提供技术支持和理论支撑，对农业生产具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 菌种

土壤中筛选出的不动杆菌（Acinetobacter indicus）JL-1，保藏于徐州工程学院微生物遗传育种实验室。

1.2 仪器与设备

723C可见分光光度计HYG（上海欣茂儀器有限公司）、旋式恒温调速摇瓶柜（上海欣蕊自动化设备有限公司）、DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、HH.B11.600-S-Ⅱ型电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）。

1.3 培养基

1.3.1 无机磷液体培养基 10.00 g葡萄糖、25.00 g Ca3（PO4）2、0.50 g（NH4）2SO4、0.20 g NaCl、0.20 g KCl、0.10 g MgSO4·7H2O、0.03 g FeSO4·7H2O、0.03 g MnSO4·4H2O、0.50 g酵母粉，1 000 mL水，pH值为6.8～7.2，121 ℃灭菌20 min。

1.3.2 LB液体培养基 5.00 g蛋白胨、5.00 g NaCl、2.50 g牛肉浸膏、500 mL蒸馏水、pH值在7.0左右，121 ℃灭菌20 min。

1.3.3 LB固体培养基 LB液体培养基中加入琼脂粉，使其浓度为18 g/L。

1.4 试验方法

1.4.1 斜面活化 将实验室保存的不动杆菌JL-1转接至已灭菌的LB斜面，置30 ℃恒温培养箱活化培养24 h。

1.4.2 种子液制备 用接种环刮取斜面菌株接入100 mL LB液体培养基中，于30 ℃、150 r/min恒温振荡器中培养 24 h 得种子液。

1.4.3 液体发酵检测菌株解磷能力 以1%（体积比）接种量将种子液接入无机磷液体培养基中，装液量为 100 mL/250 mL，于30 ℃、150 r/min恒温振荡器中培养48 h，发酵液于8 000 r/min离心15 min，检测上清液中的磷含量，以不接菌的处理作为对照。采用磷钼蓝比色法测定磷含量[13]。

1.4.4 菌株JL-1最适解磷条件研究

1.4.4.1 单因素试验 选取不同浓度碳源（葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乳糖、羧甲基纤维素钠）、不同浓度氮源（硫酸铵、草酸铵、硝酸钾、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨）、初始pH值（5.5、6.5、7.0、7.5、8.5）、温度（25 ℃、28 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃）、装液量（30、50、80、100、120 mL），测定其对菌株JL-1解磷能力的影响。

1.4.4.2 正交试验 在单因素试验基础上，选取碳源浓度、氮源浓度、初始pH值、温度等4个较为显著的影响因素，采用L16（34）正交表进一步研究这4个因素对菌株JL-1解磷能力的影响，因素水平见表1。

1.4.5 菌株JL-1解磷曲线 将菌株JL-1在最佳发酵条件下连续培养72 h，从0 h起，每12 h取样1次，测定菌落数、pH值及解磷量。采用稀释涂布法测定菌落数，将发酵液用无菌水准确稀释至10-8、10-9、10-10，用涂布棒缓慢均匀地涂布在准备好的LB固体培养基上，每个稀释度做3个平行，48 h后计数平板上的菌落数，取3组平行的平均值。

1.4.6 菌株JL-1解磷机制 将菌株于最佳条件下培养 48 h 后，使用细菌过滤器将发酵液过滤除菌，作以下4种处理：（1）置于121 ℃灭菌5 min使酶类失活，以测定过滤液中各种有机酸类对磷酸钙的溶解效果;（2）在无菌条件下调节pH值至7.0，以消除滤液中各类有机酸的影响，测定滤液中酶类对磷酸钙的溶解作用;（3）既不调节pH值，也不做灭活处理，以测定滤液中酶类和有机酸对磷酸钙的共同作用;（4）设置对照（CK），即灭活并调节pH值。上述4种处理各 50 mL，与50 mL新鲜的无机磷培养基混合后，置于37 ℃、150 r/min 的恒温振荡器中振荡培养48 h，测定上清液中的磷含量。同时，将 100 mL 无机磷培养基装入锥形瓶中，用盐酸分别调节培养基pH值为2.5、3.5、4.5、5.5、6.5，置于37 ℃、150 r/min恒温振荡器中振荡培养48 h后，测定上清液中的磷含量。

2 结果与分析

2.1 碳源对菌株JL-1解磷能力的影响

2.1.1 不同碳源对菌株解磷能力的影响 碳源是微生物生长过程中所必需的一种养分，微生物对不同碳源的利用能力不同导致其生长及代谢速度不同，从而影响菌株的解磷能力。由图1可知，菌株JL-1在以蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖为碳源时，具有较强的解磷能力，且以蔗糖为碳源时解磷能力最好。这表明菌株JL-1能够较好地利用蔗糖，且蔗糖的成本低于葡萄糖，有利于大规模发酵。因此，确定最佳碳源为蔗糖。

2.1.2 碳源浓度对菌株JL-1解磷能力的影响 由图2可知，解磷量随蔗糖浓度的增大呈先升高后下降的趋势，当蔗糖浓度为15 g/L时解磷效果最好。

2.2 氮源对菌株JL-1解磷能力的影响

2.2.1 不同氮源对菌株解磷能力的影响 氮是构成微生物重要生命物质蛋白质、核酸等的主要元素，是微生物生长的主要营养物[14]。由于微生物对不同氮源的吸收转化及利用能力不同，选择最佳的氮源能有效地提高解磷菌的解磷能力。由图3可知，使用单一氮源时，有机氮源酵母粉最佳，解磷量为51.35 μg/mL，无机氮源硫酸铵最佳，解磷量为 29.40 μg/mL，这与杨慧等的研究结果[15]一致。采用硫酸铵与酵母粉等质量浓度复合，与单独使用这2种氮源进行比较，由图4可知，2种氮源复合时解磷量最高为54.15 μg/mL，优于单一氮源的解磷量。因此，菌株JL-1的最优氮源为酵母粉和硫酸铵组成的复合氮源。

2.2.2 氮源浓度对菌株JL-1解磷能力的影响 影响微生物代谢的一个重要因素是碳氮比，因此不同的氮源浓度对菌株解磷能力有很大影响。由图5可知，氮源浓度在0.5～1.5 g/L 范围内，解磷量逐渐增加;氮源浓度在1.5～2.5 g/L范围内，解磷量逐渐下降，因此，解磷菌JL-1的最适氮源浓度为1.5 g/L。

2.3 初始pH值对菌株解磷能力的影响

pH值除了直接影响微生物细胞以外，还对细胞产生一些间接影响，例如pH值能够使生物细胞膜上所带的大量电荷发生改变，严重影响细胞吸收的营养物的离子化程度，致使微生物细胞吸收营养物质的能力发生极大改变[16]。因此，确定合适的初始pH值，有利于提高解磷的能力和效率。由图6可知，初始pH值在5.5～7.0之间解磷量逐渐增加;初始pH值在 7.0～8.5之间解磷量逐渐下降，因此解磷最适pH值为7.0，偏酸或偏碱均不利于菌株进行解磷。

2.4 温度对菌株JL-1解磷能力的影响

温度为影响微生物生长和代谢环境条件中的重要因素之一，当温度在微生物能够适应的最适范围内缓慢变化时，它的生长和代谢也会同时发生相应的变化。若外界环境超过这个温度范围，就会导致该生物生长发育困难和代谢水平急剧下降。由图7可知，在25～30 ℃之间，随着温度升高解磷量逐渐升高，在30～40 ℃之間解磷量逐渐降低，由此可以确定菌株最适解磷温度为30 ℃。此时菌株生长代谢旺盛，有利于对磷酸钙的降解。

2.5 装液量对菌株JL-1解磷能力的影响

绝大多数微生物生长发育及其代谢过程中须要消耗氧气，因此培养液中的溶解氧也会对菌体的生长代谢有一定的影响，进而影响菌体的解磷能力。装液量在30～120 mL范围内变化时，解磷量呈先升后降的趋势，当装液量为50 mL时，解磷效果最好，当溶解氧减少时菌株解磷效果渐差，表明解磷菌好氧。在装液量为30 mL时，虽然菌体与空气接触的机会大，但可能是由于装液量太少，在摇床中培养时，菌体与摇瓶之间的剧烈撞击对菌体造成些许不良影响，影响到菌体的解磷，导致解磷量较50 mL时有所下降[17]。

2.6 正交试验确定解磷最佳条件

选取解磷过程中的主要影响因素（碳源浓度、氮源浓度、温度、初始pH值）进行正交试验，结果见表2。由k值可以看出最优组合为A1B3C3D3，该组合在正交试验的9组试验中的解磷量也最高，由此确定菌株JL-1的最适解磷条件：碳源浓度为10.0 g/L，复合氮源（硫酸铵与酵母粉质量浓度比为 1 ∶ 1）浓度为2.0 g/L，初始pH值为7.5，温度为37 ℃，装液量为50 mL/250 mL。从R值看出4个因素对解磷量的影响表现为氮源浓度>碳源浓度>温度>pH值，这与方差分析结果是一致的，由表3可以看出，氮源浓度对菌株JL-1解磷能力的影响是显著的（P<0.05），这表明相对于其他3个因素，氮源浓度是影响菌株解磷能力的最主要因素。