杨旭颖 安丽君

摘要：表皮毛是由高等植物地上部组织表皮细胞发育而来的一种特殊结构，细胞周期调控因子在植物表皮毛细胞形态的建成过程中发挥着重要作用。利用原核表达系统，构建pET-28a-KRP2-FLAG融合表达载体，在大肠杆菌中对拟南芥细胞周期依赖激酶抑制因子KRP2进行了体外表达，并利用蛋白标签FLAG和His对目的蛋白进行纯化。结果表明，在大肠杆菌系统中成功对KRP2-FLAG进行了体外表达并得到了纯化的蛋白，蛋白量为0.87 mg。这为进一步研究KRP2在表皮毛细胞发育过程中的作用奠定了基础。

关键词：表皮毛;细胞周期调控因子;KRP2;原核表达;FLAG标签;His标签;蛋白纯化;拟南芥;基因克隆;重组蛋白

中图分类号： Q78;S188+.2  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）12-0063-03

植物表皮毛是植物地上组织表皮细胞形成的一种特化结构，与表皮铺板细胞持续进行有丝分裂不同，表皮毛细胞在命运决定之后将退出有丝分裂周期转而进入核内复制。在模式植物拟南芥中，成熟的叶片表皮毛细胞需要经历4次核内复制，从而使其核内DNA含量达到32C，进而形成特定的形态[1]。细胞周期调控因子在细胞由有丝分裂向核内复制转换的过程中发挥着关键的调节作用，其中细胞周期素依赖性激酶（CDK）是植物细胞周期的中心调控因子，细胞周期的一些进程是通过调节CDKs活性进行的[2]。与细胞周期素相对的是CDK抑制因子，它通过与CDKs直接结合负调控CDKs活性[3]。植物中第1种CDK抑制因子是由7种基因共同编码的kip相关蛋白家族（KRP）：ICK1/KRP1、ICK2/KRP2、KRP3、KRP4、KRP5、KRP6、KRP7。ICK1/KRP1、ICK2/KRP2、KRP6过表达强烈抑制生长并且影响器官形态建成。KRPs是一类带有C末端区域（CTD）的小蛋白，它是结合CDK或细胞周期蛋白并执行KRPs抑制功能所必需的一类因子[4]。而CDK活性在G1/M期和G2/M期转换时会升高并且与蛋白磷酸化、起始DNA复制、有丝分裂相关;转录水平调控、蛋白互作、转录后修饰或蛋白降解都能改变CDK活性，最终调控细胞周期进程[5]。酵母双杂体系中除了KRP5，其他KRPs都与CDKA;1（A类CDK激酶）互作而不与CDKB1;1互作，并且所有的KRPs可以与D型细胞周期素互作，表明KRPs抑制CYCD-CDKA复合物活性[6]。

CDKA;1和其特异性抑制因子KRP2调控拟南芥叶片发育过程中有丝分裂向核内复制的转换。在有丝分裂活性组织中，调节KRP2过表达可降低CDKA;1活性，而在核内复制的组织中它的活性不会降低，反而促进核内复制。CDKA;1的弱表达导致了CDK有丝分裂活性的特异性抑制，从而诱导核内周期。CDKB1;1通过使KRP2磷酸化调控蛋白酶体降解;CDKB1;1的mRNA和蛋白水平在有丝分裂组织中要高于核内复制组织，表明CDKB1;1促进KRP2降解并且通过维持CDKA;1活性来抑制有丝分裂进入核内周期[7]。KRP2蛋白可以通過CDK磷酸化和蛋白酶体降解机制调节转录后翻译[8]，不同CDK蛋白之间的互作可以控制不同时期特异的CDK活性。

为进一步研究KRP2在高等植物细胞周期中的生物学功能，本研究对拟南芥KRP2基因CDS序列进行克隆，并在其3′端添加编码FLAG标签的核苷酸序列，构建了pET-28a-KRP2-FLAG融合表达载体;通过在大肠杆菌BL21（DE3）中体外表达，利用镍柱亲和层析纯化，成功获得了His-KRP2-FLAG重组蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料、菌株和载体 拟南芥Columbia（Col-0）生态型野生型种子、大肠杆菌TOP10和BL21（DE3）、原核表达载体pET-28a，均由西北农林科技大学生命科学学院分子遗传实验室保存。

1.1.2 试剂 试验中用到的限制性内切酶、高保真DNA聚合酶Prime Star、T4连接酶、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）、反转录酶等购自Takara公司;His标签蛋白纯化柱填料Ni Sepharose 6 Fast Flow、硝酸纤维素膜（0.45 μm），购自通用电气医疗集团生命科学部;6xHis抗体购自Abcam公司，FLAG抗体购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥KRP2基因片段克隆 提取野生型拟南芥总RNA，反转录获得cDNA;以此为模板用带BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物进行PCR扩增;引物序列F：5′-CATGGATCCATGGCGGCGGTTAGGAGAAG-3′;R：5′-CATCTCGAGTCACTTATCATCATCATCTTTATAATCTGGATTCAATTTAACCC-3′（下划线分别表示BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点），引物由北京六合华大基因有限生物公司合成。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切扩增片段和pET-28a载体，连接酶切产物并转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，对阳性重组质粒pET-28a-KRP2-FLAG进行测序鉴定[9]。

1.2.2 重组蛋白的诱导表达 将测序正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株中，过夜培养后挑取阳性单克隆接种到50 mL LB液体培养基中，37 ℃、220 r/min小规模培养，待菌液D600 nm达到0.5～1.0时，加入终浓度为 0.2 mmol/L 的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），于 37 ℃ 诱导表达。分别收集诱导前和诱导后菌液，4 000 g离心10 min，收集菌体并用裂解缓冲液Lysis Buffer[50 mmol/L NaH2PO4（pH值8.0），300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑]重悬，冰浴，进行超声破碎（25 W，工作5 s，间歇5 s，15 min），结束后4 ℃、1 000 g离心30 min，分别收集上清和沉淀。以诱导前菌液为对照，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳检测重组蛋白的表达情况，之后利用BIO-RAD凝胶成像软件分析诱导出的蛋白量，以不同梯度（0.125，0.250，0.500，1.000 mg/mL） 牛血清白蛋白BSA质量浓度为标准对照[10-11]。

由于重组蛋白N端带有His，C端带有FLAG标签，所以本试验同时用Anti-His和Anti-FLAG进行免疫印迹检测。将2份蛋白样品通过电转仪转移到硝酸纤维素膜上，室温条件下用含50 g/L脱脂奶粉的TBST[20 mmol/L Tris-HCl（pH值7.5），体积分数0.1%的Tween 20，150 mmol/L NaCl]封闭 1 h，然后分别加入经封闭液稀释的Anti-His（1 ∶ 10 000，体积比）和Anti-FLAG（1 ∶ 1 000，体积比）4 ℃过夜孵育，次日将2块膜用1×TBST洗3次，然后均加入鼠抗G&M（1 ∶ 10 000 体积比）室温孵育 1 h，1×TBST洗3次，再用TBS洗膜 5 min，加入ECL工作液進行显色。

1.2.3 重组蛋白的纯化 重组蛋白小规模原核表达成功后，按照原条件进行目标蛋白扩大培养，收集400 mL IPTG诱导后的菌液，4 ℃、10 000 g离心10 min，菌体用Lysis Buffer重悬，因为后续试验需要有活性的蛋白，故超声破碎后离心收集上清，并将上清用0.22 μm滤膜超滤，然后和600 μL镍柱混合，室温孵育1 h，转入简易重力柱装置中，分别用0、50、100、200、400 mmol/L浓度的咪唑洗脱蛋白并检测[12-13]。

2 结果与分析

2.1 拟南芥KRP2目的基因片段克隆

由拟南芥基因组数据库（www.arabidopsis.org）公布的基因序列可知，KRP2基因的CDS长度为666 bp。以野生型拟南芥cDNA为模板，用带有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物扩增得到了与预期大小吻合的片段（图1）;用BamHⅠ和XhoⅠ酶切目的片段与pET-28a载体（图2），目的基因的条带约为650 bp，载体骨架的大小约为5.3 ku。

2.2 原核表达载体pET-28a-KRP2的鉴定

目的基因片段与载体连接，连接产物转化大肠杆菌后选取阳性克隆并提取质粒DNA进行双酶切，经电泳检测表明目的基因片段成功克隆到了pET-28a表达载体中（图3）。为了验证克隆到载体中的目的基因片段序列是否正确，将 pET-28a-KRP2重组质粒进行了测序，结果表明克隆到的序列与数据库公布的序列完全一致，pET-28a-KRP2重组质粒构建成功，基因结构如图4所示。

2.3 重组蛋白的诱导表达

将构建好的pET-28a-KRP2重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，建立重组蛋白的原核表达系统。37 ℃、0.2 mmol/L IPTG诱导表达。取诱导前，诱导后及超声波处理后的上清和沉淀检测诱导表达情况。结果显示，诱导后的菌液相比于诱导前在25～37 ku出现了新的蛋白条带（图5），与预测的KRP2蛋白分子量一致。为了进一步确认诱导表达出的蛋白条带是目的KRP2-FLAG重组蛋白，分别以His和FLAG蛋白标签的抗体对诱导出的蛋白进行免疫印迹检测，结果表明诱导出的新蛋白条带能被His标签抗体和FLAG标签抗体识别，证明本试验利用原核表达系统成功诱导出KRP2-FLAG蛋白，且重组蛋白主要存在于沉淀，上清中量较少，表明得到的重组蛋白主要以包涵体形式存在。通过Image Lab软件灰度分析对目的蛋白浓度进行定量，得到诱导后重组蛋白浓度约为0.181 mg/mL。

2.4 KRP2-FLAG重组蛋白的纯化

试验后续是研究KRP2与CDKA;1、CDKB1;1三者之间的互作效应， 需要具有活性的KRP2蛋白，而沉淀中的KRP2蛋白以不溶性包涵体形式存在，几乎没有活性，因而考虑通过扩大培养菌体，利用镍柱亲和层析纯化上清中的活性重组蛋白。将诱导后的菌液经超声波破碎后离心收集上清，与镍柱室温孵育后，用不同浓度咪唑洗脱并收集KRP2-FLAG蛋白，SDS-PAGE与免疫印迹检测洗脱液。本试验成功获得了纯度较高的重组蛋白，且利用BSA标准蛋白定量，最终共得到0.87 mg重组蛋白（图6）。

3 讨论与结论

植物中细胞分化调控已经取得了相当不错的进展，然而对高度可信的植物发育调控还没有一个较好的解释。目前研究证明了一些通过转录因子直接控制细胞周期的相关基因，发现与细胞周期调控有关的因子主要包括三大类：细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子，这3类因子相互作用，共同调控细胞周期[14]。KRP2作为CDK抑制因子之一，在G1/S转换期，被泛素酶体降解掉，CDK被激活，进入S期。有丝分裂周期向核内周期的转换机制对揭示细胞分化和器官大小控制进程具有重要作用，为进一步研究KRP2在高等植物中如何控制细胞进程，本研究通过克隆拟南芥KRP2基因，以及原核表达并纯化出具有活性的重组KRP2-FLAG蛋白，以期为后续研究有丝分裂向核内周期转换时CDKA;1、KRP2和CDKB1;1三者之间更为精确的互作效应奠定基础。

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