刘美琪，汤轶波，郑燕飞，白 雪，谭天阳，李 月，李韵歆，马 茹，陈亚飞，刘振权△，王 琦△

(1. 北京中医药大学中药学院，北京 102488； 2. 北京中医药大学中医学院，北京 100029)

近年来，我国男性精子质量普遍下降，男性不育已成为全社会普遍关注的问题[1]。研究发现，少弱精、无精患者约占男性不育的48.49%[2]。发展中国家和工业化国家生育率的逐渐降低，虽然部分归因于社会经济和文化的改变，但环境对男性生殖系统的损害仍是其中不可忽视的重要因素[3]；男性生殖系统对环境暴露十分敏感，现代化生活中的工业污染、不良习惯、电子设备辐射等均与男性生殖功能受损直接相关[4-5]。男性不育患者社会压力大、家庭关系紧张[6]，因此男性不育症的防治已成为社会公共卫生领域面临的几大挑战之一。

中医学认为肾藏精，主生殖，治疗男性不育应以补肾论治。专长治疗男科疾病的国医大师王琦教授认为，男性不育的主要病机为“肾精亏虚，兼夹病邪”[7]，其临床治疗少弱精子多加以中药鱼鳔组方，取得良好疗效。

鱼鳔性味甘平、入肾经，具有补肾益精、滋阴养血的功效，用于治疗肾虚滑精所致的男性不育、腰膝酸软[8-9]。《本草求原》记载，鱼鳔有“养筋脉，定手战，固精”的功用[10]，现代《浙江省中药炮制规范》是最早收录鱼鳔的炮制规定[11]。然而，鱼鳔改善精子质量的药理实验研究目前尚少见报道。本实验通过研究鱼鳔对少弱精子小鼠精子质量的改善作用，为临床应用鱼鳔防治男性不育症提供基础研究支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD小鼠48只，体质量18～20 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供*许可证号SCXK(京)2016-0006)。小鼠均自由饮水和采食，每天更换垫料及饲料，保持环境干燥清洁，环境温度23±2 ℃。

1.1.2 实验用药及试剂 鱼鳔：饮片购买于北京同仁堂北苑店；五子衍宗丸：购自北京同仁堂股份有限公司(批号17035273)。环磷酰胺：由Baxter Oncology GmbH生产(批号7J193A)；培养基M199(Life Technologies Corporation)(批号1917554)。

1.1.3 主要实验仪器 精子分析仪：清华同方3.0版，热台：DB-B2，徕卡微软韦茨拉有限公司；移液器：Easypet3，艾本德中国有限公司北京分公司；天平：TE4101，北京赛多利斯仪器和系统工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及给药 小鼠适应性喂养1周，按随机数字表法分为正常组、模型组、鱼鳔低、中、高剂量组、五子衍宗丸组，每组各8只。除正常组外，其余各组小鼠均腹腔注射环磷酰胺60 mg/kg，持续5 d，建立少弱精子模型。从第6天开始，正常组和模型组以蒸馏水灌胃。鱼鳔低、中、高各剂量组以人体等效剂量5、10、20倍用量灌胃鱼鳔水煎液，分别为1.42 g/kg、2.85 g/kg、5.71 g/kg。鱼鳔饮片水煎液制备方法为纯净水浸泡0.5 h，大火煎煮0.5 h。五子衍宗丸组以五子衍宗丸灌胃(1.71 g/kg)，每日1次，连续灌胃2周。末次给药后，禁食12 h并处死小鼠，进行后续检测。

1.2.2 睾丸与附睾指数 取小鼠睾丸和附睾称重，计算睾丸重/体质量和附睾重/体质量。

1.2.3 测试精子质量 根据参考文献[12]，用手术剪刀迅速分离附睾尾，并分离附睾尾上的脂肪组织，将附睾尾放入提前预热37 ℃的M199培养基中，将附睾尾剪碎轻轻震荡均匀，使精子充分游出。取10 μL精子悬浮液放入精子计板上，选取6个视野，于2 min内完成测试。主要检测指标为精子浓度(×106/ml)、精子活力(%)、精子活率(%)、精子畸形率(%)。

1.3 统计学方法

2 结果

表1显示，腹腔注射环磷酰胺后，模型组小鼠精子浓度、精子活率与精子活力均显著低于正常组(P<0.05)，精子畸形率与正常组比较显著增加(P<0.05)，附睾指数、睾丸指数与正常组比较明显下降(P<0.05)，差异有统计学意义，提示造模成功。

表1显示，连续给药2周后，五子衍宗丸组与鱼鳔高、中、低各剂量组小鼠精子浓度、精子活率和精子活力均明显高于模型组(P<0.05)，五子衍宗丸与鱼鳔高、中剂量组小鼠精子畸形率较模型组有显著降低(P<0.05)，五子衍宗丸与鱼鳔高、中、低剂量组小鼠睾丸指数、附睾指数显著高于模型组(P<0.05)，差异有统计学意义。

表1 鱼鳔对少弱精子症小鼠精子质量的影响

注: 与正常组比较:#P<0.05; 与模型组比较:*P<0.05

3 讨论

现代医学认为，少弱精子症多由精索静脉曲张、内分泌失调、微量元素缺乏以及不健康的生活方式等因素导致[13]。精子浓度、精子活力、精子活率和精子畸形率为评价精子质量的重要指标，精子质量越高说明受孕的几率越大。其中精子浓度为每1 ml精子悬浮液中所含精子量；精子活力为样品中向前运动精子占精子总数的百分比，即a级+b级精子占总精子的百分率；精子活率为样品中运动精子占总精子数的百分率，即a级+b级+c级精子占总精子的百分率；精子畸形率表示精子形态发生变异的精子占总精子的百分率[14-15]。

环磷酰胺是烷化剂类抗肿瘤药物，具有较强的免疫抑制作用，可对男性生殖系统造成损伤，导致精子染色体突变、无精症或少精症[16-17]。腹腔注射环磷酰胺可导致小鼠精子畸形率升高，精子数、精子活力和生存能力明显降低[18]；损伤大鼠睾丸组织形态，增大睾丸生精小管间隙，使各级生精细胞分布密度下降[19]。故本实验采用环磷酰胺制备少弱精子症模型，经腹腔注射环磷酰胺后，小鼠表现为精神萎靡不振，蜷缩畏寒，类似于中医肾虚证；模型组精子浓度、精子活力、精子活率和精子畸形率较正常组明显下降，与其他相关研究结果相符，由此可推测造模成功。

治疗男性不育的相关研究进展缓慢，现代医学主要应用L-肉碱类和激素类药物，但上述药物单用效果不显著，易产生药物依赖，且激素副作用较大，临床上应用受到限制[20]。《素问·六节藏象论篇》记载：“肾者主蛰，封藏之本，精之处也。”中医学认为，肾为先天之本、藏精之处，肾气是否充足、肾精是否充盈，与生殖机能的强弱息息相关；男性不育症的病机常为肾虚，应从补肾益精种子为主旨[21-22]。

鱼鳔素有“海洋之参”的美誉，最初外用治疗出血、疮疡，明清后主要用于补肾固精。清代《本草新编》有云：“鱼鳔，味甘，气温，入肾经。专补精益阴，更能生子。[23]”《外科大成》记载其“治遍身酸软作痛者、腰痛”[24]。《本草撮要》记载：“线鱼鳔，味甘咸，入足阴明经，功专补益精气。[25]”鱼鳔更为“血肉有情之品”，具有滋阴补肾、填精养血的功效，临床多用于治疗肾虚封藏不固导致的梦遗滑泄、腰膝无力。应用鱼鳔治疗少精弱精症的方剂亦有诸多记载，如《本经逢源》记载了鱼鳔胶入丸炮制方法，以及鱼鳔与沙苑蒺藜组方而成的固精丸，用于肾虚不固、遗精滑泄[26]；《拔萃良方》收载的鱼鳔丸在前者基础上增添了当归、肉苁蓉、莲须与菟丝子，治疗肾阴不足之症[27]；《证治准绳》中，聚精丸则较固精丸增加五味子，制蜜丸治疗肾虚滑精[28]。

王琦针对男性不育疾病提出的“精室论”假说[29]，打破传统中医单纯补肾的观念，认为精室为肾所属，而与肾经和督脉相通，主生精、泌精液；精室之病主要为精液病，包括少精、无精、弱精和精冷等。临床少弱精子不育患者主要以肾阴、肾精亏虚为主，可兼有湿热、瘀(精瘀血瘀)、毒(有害环境)或虫(微生物感染)。王琦创制的男性不育主方“升精赞育汤”，方用生地黄、桑椹、枸杞以滋阴补肾，紫河车补肾益气，巴戟天、仙灵脾温阳化气，茯苓、泽泻以渗泄湿热，牡丹皮以凉血化瘀。在实际辨证治疗中，需结合患者具体症状对该主方进行加减调整，尤其针对少弱精子者，为保契合病机，在前期补肾获效后，常取“精血相生”之法调整组方，加入“血肉有情之品”，鱼鳔胶以增强本方剂补益精血的功效，气血并补，往往取得良好疗效[30-31]。

现代研究发现，氧化应激是造成男性不育的原因之一[32]。鱼鳔中胶原蛋白的含量高达80%左右，鱼鳔明胶具有较强的抗氧化能力[33]，鱼鳔中的蛋白水解产物也有抗氧化、抗疲劳的作用，可能印证鱼鳔“补肾”的功效[34-35]。鱼鳔是否通过抗氧化应激等通路改善少弱精子，还有待进一步研究。鱼鳔中氨基酸含量丰富、种类全面，其中甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和精氨酸等含量最高，这些氨基酸在临床已被用于维持前列腺健康、治疗少精弱精症，为鱼鳔“补肾益精”提供理论基础[36]。

精子活力与精子活率都是衡量精子质量的重要指标，尤其精子活力表示向前运动精子的百分比，能够更加直观地反映精子质量。在本研究中，鱼鳔中、高剂量组小鼠的精子浓度、精子活率和精子活力与模型组比较均有显著提升，表明鱼鳔可以增加精子数量，提高精子运动活力，且成剂量相关性；此外，精子畸形表现为头、体、尾的形态畸变，包括巨大头、双头、体部折裂、卷尾、缺尾等[37]，临床上畸形精子所占百分比用精子畸形率表示，超过30%时则为高畸形率精子，可对生育造成严重影响[38]。本实验鱼鳔中、高剂量组精子畸形率显著降低，说明鱼鳔也可能通过降低精子形态畸变改善男性不育症，且随着浓度增高，鱼鳔降低精子畸形率的作用逐渐加强。鱼鳔低剂量组的精子活力和精子畸形率未被改善，考虑原因可能是尚未达到合适的药物治疗窗。

脏器系数[39]是指实验动物某脏器的质量与体质量的比值，脏器系数的降低提示该脏器发生萎缩或退行性病变。经鱼鳔干预后，小鼠睾丸系数和附睾系数[40]明显增加，说明鱼鳔对环磷酰胺引起的睾丸、附睾的病理损伤有一定改善。综上所述，鱼鳔可以明显提升少弱精子小鼠的精子质量，改善睾丸的退行性病变，对治疗男性不育症有较大的潜在价值，其药理机制还需进一步的深入研究。