顾香 陈吉泉 李兵

【摘要】 目的：通过分子生物学技术构建重组人白介素35（IL-35）质粒，为进一步研究人IL-35的生物学功能奠定基础。方法：用KG-1细胞（人白血病细胞）扩增p35和EBI3的cDNA，将两者先后连接至pSectag2A质粒中，最后把Linker连接至pSectag2A-p35-EBI3中，构建成pSectag2A-IL-35质粒。结果：经测序等方法鉴定重组质粒中p35和EBI3序列与Genbank中（p35 NM-000882和EBI3 NM-005725）公布的序列一致。结论：成功构建pSectag2A-IL-35真核表达载体。

【关键词】 重组; PCR; IL-35; 质粒

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.17.078 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2019）17-0-03

【Abstract】 Objective：To construct recombinant human IL-35 expression vector by molecular biology technique，which could lay a foundation for further study of the biological function of IL-35.Method：EBI3 and p35 were amplified by PCR from the cDNA library derived from the KG-1 cells.And they were cloned into pSectag2A vector.Finally Linker was cloned into pSectag2A-EBI3-p35，and pSectag2A-IL-35 plasmid was successfully reconstructed.Result：The pSectag2A-IL-35 vector was verified by DNA sequencing，whose sequencing were consistent with those published in Genbank（EBI3 nm-005725，p35 nm-000882）.Conclusion：Psectag2a-IL-35 eukaryotic expression vector is successfully constructed.

【Key words】 Recombinant; PCR; IL-35; Plasmid

First-authors address：Shanghai Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

IL-35是白介素12家族的一員，1997年Devergne等[1]报道了IL-35是由白介素12的p35亚基（IL-12 p35，即p35）和EB病毒诱导基因3（EBI3）构成。p35及EBI3基因编码分子量分别为35、34 kD的糖蛋白[2]。2007年Collison等[3]经小鼠体内实验初步证实，调节性T细胞（Treg细胞）可高表达EBI3和p35，且两者的二聚体能加强Tregs的免疫抑制功效。2007第13届免疫学国际会议上，由Vignali首次提议该二聚体命名为IL-35，最后成功获批。自此，IL-35就成为免疫学、分子生物学等领域研究的热点。本实验拟构建人IL-35质粒，为深入研究IL-35的生物学作用及其机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株和质粒 人白血病细胞株KG-1由华东理工大学代同成博士惠赠，pSectag2A载体由英国格拉斯哥大学Wei Xiaoqing教授惠赠。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ、NotⅠ、XhoⅠ，DL2000 Marker、T4DNA连接酶、质粒抽提试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）、T载体（TAKARA）、DNA胶回收试剂盒、RNA提取试剂。

1.1.3 培养基 DMEM高糖培养基购自GIBICO公司，Hyclone胎牛血清。

1.2 方法

1.2.1 p35和EBI3 cDNA的克隆 按照p35和EBI3在NCBI的GenBank中的cDNA序列，利用Primer Premier 5软件设计引物。依照pSectag2A质粒图谱，筛选酶切位点。在EBI3上游引物的5端加上4个保护碱基并引入HindⅢ酶切位点：AAAGAAGCTTTGCCCGCCCTGCAGTGGA，EBI3下游引物的5端加上5个保护碱基并引入EcoRⅠ及NotⅠ酶切位点：ATTAAGAATTCGCGGCCGCGCCCAGGCTCATTGTGG;在p35上游引物的……