吴春涛，刘苏，李拥军，唐闽，刘钰，李倩

(河北医科大学第二医院，石家庄050000)

高血压病严重危害人类生命和健康。血压长期持续增高使心脏和血管结构发生改变，从而出现靶器官损伤及并发症。高血压病靶器官损伤主要表现之一为左心室肥厚，即心室重构，一旦出现容易引起心律失常和心力衰竭[1，2]。有效逆转左心室肥厚和延缓心室重构是高血压病治疗的重点。左心室重构主要表现为心肌细胞肥大、心肌凋亡增加、非心肌细胞(成肌纤维细胞)及非细胞成分(胶原纤维)增加、心肌电生理和代谢异常。早期的左心室重构以心肌细胞肥大为主，伴随心肌细胞凋亡，结缔组织增生(主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原)；后期因Ⅰ/Ⅲ型胶原比例的增加，左心室顺应性降低，心功能日趋恶化，心室舒张功能减退。我们前期实验证实微小RNA455(miRNA-455)通过其靶基因钙网蛋白(Calr)参与升主动脉缩窄后小鼠的心室重构[3]。本研究观察了合并左心室肥厚的高血压患者血清miRNA-455水平变化，分析其与心肌纤维化指标的相关性，以期为评估高血压病情提供新的参考指标，也为高血压的诊断治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年2～12月于河北医科大学第二医院心血管内科确诊、未经治疗的原发性高血压患者140例为研究对象，其中高血压2级以上合并左心室肥厚者60例(病例组，男34例、女26例)，单纯高血压2级以上者80例(病例对照组，男42例、女38例)。排除有继发性高血压病、糖尿病和其他心血管疾病患者。另选取在本院进行健康体检的正常人50例作为健康对照组，男27例、女23例。病例组、病例对照组与健康对照组的年龄、性别、有吸烟史者(分别为18、25、13例)、血糖、BMI和肌酐水平等资料差异无统计学意义。病例组、病例对照组的收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、左心室质量指数(LVMI)高于健康对照组，且病例组LVMI高于病例对照组(P均<0.01)。见表1。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

表1 三组一般资料比较

注：与健康对照组相比，**P<0.01；与病例对照组相比，##P<0.01。

1.2 miRNA-455检测 抽取各组桡动脉血5 mL于含EDTA抗凝剂的采血管中，静置1 h，室温1 200 r/min离心15 min。提取上清液分装到去RNA酶的EP管中，再以8 000 r/min充分离心5 min，取上层血浆每500 μL分装至RNase-free EP管中，最终每例收集2～3管，然后放置到-80 ℃低温冰箱中保存待用。将离心得到的血浆取500 μL到新的离心管中，按照试剂操作说明提取样本总RNA，放置于-80 ℃低温冰箱中保存。配制25 μL体系的逆转录反应液进行逆转录，得到cDNA。以RNU6B为内参，进行PCR反应，ABI 7500仪检测miRNA-455的Ct值。以2-ΔCt作为目的miRNA的相对表达量。

1.3 血清心肌纤维化指标检测 病例组和病例对照组于入院后次日晨(空腹12 h以上)仰卧休息30 min后、健康对照组于体检当日抽取静脉血3～4 mL，室温下凝固，4 000 r/min离心10 min，收集上清液，-80 ℃冰箱保存。采用ELISA法检测各组血清基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)、Ⅰ型胶原氨基端肽(PⅠNP)和Ⅲ型胶原氨基端肽(PⅢNP)，按试剂盒说明进行操作。

2 结果

2.1 各组血清miRNA-455相对表达量比较 病例组、病例对照组、健康对照组血清miRNA-455相对表达量分别0.000 071±0.000 044、0.000 230±0.000 066、0.000 385±0.000 242，病例组和病例对照组血清miRNA-455相对表达量低于健康对照组，且病例组低于病例对照组(P均<0.05)。

2.2 各组血清心肌纤维化指标比较 病例组、病例对照组血清PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平高于健康对照组，且病例组PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平高于病例对照组(P均<0.05)。病例组、病例对照组MMP-9/TIMP-1低于健康对照组，且病例组MMP-9/TIMP-1低于病例对照组(P均<0.05)。详见表2。

表2 各组血清PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平及MMP-9/TIMP-1比较

注：与健康对照组相比，*P<0.05；与病例对照组相比，#P<0.05。

2.3 血清miRNA-455表达与心肌纤维化指标水平的相关性 将所有研究对象的血清miRNA-455表达水平与血清纤维化指标进行相关性分析发现，血清miRNA-455表达水平与血清PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平均呈负相关(r分别为-0.759、-0.823、-0.630、-0.682，P均<0.05)。

3 讨论

高血压后心室重构主要表现为心肌细胞肥大和心肌细胞外基质(ECM)重构。早期的左心室重构主要以心肌细胞肥大为主，伴随心肌细胞凋亡，这其实是心脏对压力负荷增加的代偿反应，可以降低升高的室壁张力，维持乃至增加射血分数。但随着病变进行性发展到后期，凋亡的心肌细胞逐渐由ECM即心肌胶原代替，导致心功能恶化(如射血分数进行性降低等)。胶原(Ⅰ、Ⅲ型胶原为主)为ECM的主要成分，占85%左右[4]，主要由占心肌细胞总数2/3的心脏成纤维细胞合成。心肌纤维化早期Ⅲ型胶原mRNA表达、后期Ⅰ型胶原及前胶原蛋白mRNA增加等，导致Ⅰ/Ⅲ型胶原比例增加，出现左心室顺应性下降，影响其舒张功能。在本研究中也可以看出，高血压患者血清Ⅰ、Ⅲ型胶原增多，尤其是在高血压合并心室肥厚的患者更为明显。胶原基因的转录及各种基质金属蛋白酶(MMPs)调节胶原的合成和降解。MMPs是一个内源性的锌依赖性酶家族，通过降解ECM，使纤维胶原降解增加，导致ECM重构。基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)是MMPs的天然抑制剂。在心肌组织中MMPs与TIMPs之间存在严格的平衡，这种平衡一旦遭到破坏，即MMPs/TIMPs比例失调(下降)会导致心肌纤维化发生与进行性发展[5]。有研究显示，虽然高血压合并心肌肥厚组的血清MMP-9、TIMP-1水平高于非心肌肥厚组，但其血清NMP-9/TIMP-1比值低于非心肌肥厚组，提示胶原代谢异常在合并心肌肥厚组中更为突出。胶原合成增多，降解抑制进一步增强，促使体内胶原沉积进一步加重,从而促进心肌纤维化的发展[6]。本研究中，血清MMP-9、TIMP-1水平随着心室肥厚的进展而明显增加，MMP-9/TIMP-1比值下降。

miRNA作为重要的表观遗传调节分子，通过转录后负性调节目的蛋白表达从而参与许多心血管疾病的发病和进展，其中包括心肌肥厚和心肌纤维化。有报道miRNA-672通过降低其靶基因JUN延缓血管紧张素Ⅱ和胰岛素样生长因子1刺激的心肌细胞肥大[7]。miRNA-221/222家族包含转化生长因子β(TGF-β)信号的几个基因(包括JNK1、TGF-β1、TGF-β2、ETS-1)，进而参与压力过负荷引起的心肌纤维化[8]。miRNA-195可通过下调与瓣膜钙化相关的SMAD7表达，从而促进ECM的重塑[9]。近年来，miRNA-455在人类疾病发病中的作用逐渐受到重视，如在经常锻炼的糖尿病小鼠体内miRNA-455表达上调，降低了加速纤维化的MMP-9的表达，从而减少了心血管并发症[10]。TGF-β1导致miRNA-455在肺成纤维细胞中表达降低，进而影响慢性阻塞性肺疾病肺组织的修复[11]。在心肌成纤维细胞中，miRNA-455表达水平与血管紧张素Ⅱ诱导的Ⅰ、Ⅲ型胶原表达呈负相关；miRNA-455表达上调会减轻心肌纤维化[12]。

本课题组前期实验发现，TAC心室重构的小鼠心肌中miRNA-455表达下调，而上调miRNA-455表达可使心肌胶原纤维明显减少，心肌纤维化指标TGF-β1、结缔组织生长因子(Ctgf)表达降低，抑制心肌纤维化进展。随着基因检测技术的发展，循环血检测也可观察miRNA表达变化，为临床研究提供新的实验室证据。研究发现，稳定型心绞痛和不稳定型心绞痛患者血浆miRNA-149、miRNA-424表达水平较健康对照者降低，而miRNA-765水平升高[13]；急性心肌梗死时，血清miRNA-1表达量高于正常对照组[14]。鉴于上述研究结果，本课题组试图观察高血压合并心心室肥厚患者血清miRNA-455的表达变化，分析其与心肌纤维化的相关性。本研究结果显示，病例组和病例对照组血清miRNA-455相对表达量低于健康对照组，且病例组低于病例对照组，表明高血压患者血miRNA-455表达呈下降趋势，在合并左心室肥厚者miRNA-455表达下降更明显，这与前期小鼠实验结果相一致。将所有研究对象的血清miRNA-455表达水平与血清纤维化指标进行相关性分析显示，血清miRNA-455表达水平与血清PⅠNP、PⅢNP、MMP-9、TIMP-1水平均呈负相关，提示心肌纤维化越严重，血中miRNA-455表达下降越显著。结合上述结果，我们推测miRNA-455水平可能有助于反映高血压合并心室肥厚的严重程度及心肌纤维化程度;miRNA-455有可能成为心室肥厚和心肌纤维化新的生物标志物，检测血miRNA-455水平有助于评估高血压治疗效果。