陈 哲，黄 静，赵 佳，梁 宏

（山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031）

连作障碍是许多蔬菜[1]、中药材[2]、果树[3]以及大田作物[4]在连年不间断种植的情况下都会出现的一种现象，作物表现为生长发育不良、易感染病虫害、产量和品质下降等[5-6]。草莓作为我国重要的园艺作物，由于耕地面积有限，大多在温室进行连续种植，因此，面临着严重的连作障碍[7-8]。

引发连作障碍的原因复杂，但其归根结底是由于土壤环境的变化[9]。连年种植单一作物导致土壤微生物区系和多样性失衡，有益微生物逐年减少、病原微生物逐渐富集，导致植物受到病菌侵染的概率增加[10-11]。因此，缓解连作障碍的关键环节之一就是调节土壤微生物的数量、活性和群落结构。

目前，生产上采取多种手段结合的综合治理方法来处理连作土壤[12-13]，例如，首先对连作土壤进行消毒处理，杀死土壤中积累的有害微生物[14]，然后通过添加有机肥或者微生物菌剂等来改良土壤环境，不仅能增加土壤的营养成分，同时还能调节土壤中微生物的多样性，满足植物生长对于土壤环境的需求，可有效缓解连作障碍。张庆华等[15]研究发现，采用棉隆消毒和生物菌肥处理草莓连作土壤，可降低微生物真菌群落的多样性，并减少或杀死土壤中的大部分致病菌属，起到有效防治草莓土传病害的作用，但该研究并没有涉及细菌多样性的变化。

敌磺钠又名敌克松，化学名称为对二甲胺基苯重氮磺酸钠，是一种常用的有杀菌作用的土壤处理剂[16]，其对真菌中腐霉菌、黑穗病菌及多种土传病害有效，属于保护性药剂，目前并没有文章报道过这类型杀菌剂对于土壤微生物多样性的影响，也没有其与微生物菌剂联合使用的相关研究。

为了进一步研究克服和消除草莓连作障碍的有效方法，本研究利用MiSeq 高通量测序平台[17-20]，选择敌磺钠处理与微生物菌肥结合的方式处理连续3 a 种植草莓的土壤，一方面探索连作土壤在敌磺钠处理前后的微生物区系变化，另一方面研究分析不同肥料在调节土壤微生物区系上的差异，从而更加全面地了解杀菌剂和微生物菌肥对土壤的作用，旨在为科学种植草莓提供全面详细的科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试草莓品种为红颜；化肥为史丹利复合肥；有机肥料为鸡粪堆肥，购自平遥县润生态肥业有限公司；绿陇复合微生物菌剂，购自山东绿陇生物科技有限公司。

1.2 试验设计

1.2.1 对连作土壤进行消毒处理 田间试验在榆次市东阳镇试验基地进行，试验地土壤为连作3 a种植草莓的土壤。将上茬草莓植株清理干净，用旋耕机进行土壤旋耕，深度达到30～40 cm，均匀喷洒敌磺钠溶液（70%可溶性粉剂15.00～18.75 kg/hm2，溶于100～150 kg 水中），处理3 d 后进行分析。

对消毒前后的土壤进行取样并分析，土样编号消毒前为A，消毒后为B。各个土壤处理采取5 点取样法，并充分混匀，用于土壤微生物分析。

测试土壤的成分为：总氮含量1.95 g/kg，有效氮22.36 mg/kg，有效磷16.85 mg/kg，有效钾232 mg/kg，pH 值6.8。

1.2.2 对连作土壤进行施肥处理 在消毒后的土壤上进行化肥、有机肥和微生物菌肥对草莓根际微生物多样性的研究，试验设3 个施肥处理，即处理1.底施传统化学肥料（复合肥750 kg/hm2，过磷酸钙600 kg/hm2）（CK）；处理2.底施普通有机肥（3 000 kg/hm2）（OF）；处理3.底施微生物菌肥和有机肥（将绿陇复合微生物菌剂（有效活菌数≥200 亿个/g，用量7.5 kg/hm2）与有机肥混合，3 000 kg/hm2）（MF）。每个处理3 个重复，共9 个小区（15.0 m×4.5 m）。

草莓种植垄垄宽为0.45 m，间距为1.0 m，草莓分2 排种植于垄上，2 排间距为25 cm，每排的株间距为15 cm。在草莓生长期可追肥1～2 次，每次施肥75～120 kg/hm2。

1.3 样品采集

在草莓进入盛花期时采集土壤样品。采样时将草莓植株从土壤中整体挖出，将与根系紧密结合的土壤小心刷下来作为根际土壤样品。每个小区按照对角线5 点取样，每点取样3 株，然后将15 株草莓的根际土壤混合成为1 个土壤样品。

1.4 生物信息学分析方法

将土样充分混匀后，送至上海派森诺生物科技有限公司完成真菌和细菌的高通量测序和分析。

1.4.1 Alpha 多样性分析 使用QIIME 软件分别计算每个样本的丰富度指数和多样性指数，其中，群落丰富度用Chao1 指数描述，其可以估计群落中实际存在的物种数，数值越高表明群落物种的丰富度越高；物种多样性用Shannon 指数描述，其可以反映样品的多样性程度，数值越高表明群落物种（程度）种类越丰富。

1.4.2 分类学组成分析 根据OUT 矩阵数据，使用QIIME 软件，获取各样本在门和属2 个分类水平上的组成和丰度分布表，比较不同样品的群落组成，分析样品间的差异。

2 结果与分析

2.1 草莓根际土壤Alpha 多样性分析

2.1.1 细菌Alpha 多样性分析 比较样品A（未处理土壤）和B（敌磺钠处理后土壤）的指数发现，敌磺钠处理后土壤细菌的Chao1 指数要高于未处理的连作土壤，而Shannon 指数则是敌磺钠处理后土壤低于未处理的连作土壤。说明敌磺钠消毒后的土壤细菌的物种数升高，而细菌多样性降低了（表1）。

表1 不同处理土壤群落丰富度和多样性指数

综合分析表1 中的3 个处理组的细菌多样性指数发现，细菌物种数目的改变和多样性的变化正好相反，Chao1 指数由高到低排列顺序为CK＞OF＞MF；Shannon 指数由高到低排列顺序为MF＞OF＞CK。种植草莓后，其根际土壤的细菌丰富度都有所升高，对照组的指数是最高的，说明作物对于土壤细菌物种数的增加起重要作用；有机肥对于物种数的增加效果要好于微生物菌肥，这可能是因为后者自身细菌的影响。与对照组相比，有机肥和微生物菌肥都提高了细菌多样性，尤其是微生物菌肥对细菌多样性的提高更加明显。

2.1.2 真菌Alpha 多样性分析 由表1 可知，样品A 真菌的Chao1 指数和Shannon 指数极高，说明连作土壤中真菌种类丰富、多样性极高；而B 的2 个指数都很低，证明敌磺钠对土壤中真菌的杀菌效果十分明显。

分析B 和3 个处理组的Chao1 指数发现，CK、OF 和MF 的物种数相差不多，但是较B 均得到了提高，分别提高了2.74 倍、2.67 倍和2.81 倍；与A的差距仍然十分明显，都不足A 的1/3。说明草莓的种植增加了土壤中的真菌物种数，3 个处理组的物种数相差不多，而施肥方式并没有明显影响土壤中真菌的物种数。

分析B 和3 个处理组的Shannon 指数发现，CK、OF 和MF 的指数要高出B 很多，说明草莓的种植明显改善了敌磺钠处理后土壤的真菌多样性。同时发现，CK 的指数与A 较为接近，而OF 和MF 则与A 相差较大，这充分说明化肥对于土壤真菌多样性的调节作用有限，远远低于有机肥和微生物菌肥对于土壤真菌多样性的影响。

2.2 群落门分类水平组成分析

2.2.1 细菌群落门水平组成分析 5 个不同处理草莓土壤（或根际土壤）中检测出的细菌（丰度值大于1%）主要来自于变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、浮霉菌门（Planctomycetes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、厚壁菌门（Firmicutes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、[thermi]门、疣微菌门（Verrucomicrobia）、od1 门和蓝藻门（Cyanobacteria）。

从图1 可以看出，B 的变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和[thermi]门的丰度值明显要高于A，尤其是拟杆菌门，丰度值的增加十分明显；其余门的丰度值均下降。说明敌磺钠可以改变土壤中某些细菌群落在门水平上的相对丰度值。

分析3 个处理组，结果发现（图2），变形菌门和放线菌门是每个处理的优势细菌门；MF 的变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、[thermi]门和蓝藻门的丰度值是最高的；OF 的浮霉菌门、拟杆菌门和od1 门最高；芽单胞菌门和疣微菌门则在CK 中最高。微生物菌肥施用后，土壤中门水平上丰度值最高的细菌门最多，有机肥次之，而对照组最少。说明在改变细菌群落上的作用方面，微生物菌肥的作用要大于有机肥的作用。

2.2.2 真菌群落门水平组成分析 5 个不同处理草莓土壤（或根际土壤）中检测出的真菌主要来自6 个门（图3，4），包括子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、接合菌门（Zygomycota）、球囊菌门（Glomeromycota）、罗兹菌门（Rozellomycota）和壶菌门（Chytridiomycot）。其中，子囊菌门是5 个处理中丰度值占绝对优势的真菌门，在B 中的丰度值达到了99.21%，高于A；在OF 中的丰度值要高于其他2 个施肥处理组。

除了子囊菌门之外，敌磺钠处理对其他门水平上的真菌丰度值影响很大，有3 个门的丰度值都降为0，说明敌磺钠杀真菌的效果比较显著，而且很有针对性；随着草莓的种植以及肥料的施用，真菌的种类及丰度值均有所恢复，但是无论是何种施肥方式处理，子囊菌门仍然保持其主要地位。

2.3 群落属分类水平组成分析

2.3.1 细菌属分类水平组成分析 5 个不同处理草莓土壤（或根际土壤）中检测出的丰度值为0.5%的有15 个属（图3），其中，变形菌门有4 个属，放线菌门有5 个属，浮霉菌门有1 个属，绿弯菌门有2个属，厚壁菌门有1 个属，[thermi]门有1 个属，疣微菌门有1 个属。

由图5 可知，经过敌磺钠处理后，土壤中的假单胞菌属（Pseudomonas）、藤黄单胞菌属（Luteimonas）、海 杆 菌 属（Marinobacter）、溶 杆 菌 属（Lysobacter）、犁头霉属（Planctomyces）、马拉杜拉放线菌属（Actinomadura）和B-42 属的丰度值升高，其余属的丰度值均降低，另外，Methylocaldum 和席藻（Phormidium）的丰度值变成0。

从图6 可以看出，MF 的假单胞菌属、藤黄单胞菌属、溶杆菌属、链霉菌属（Streptomyces）、绿线菌属（Chloronema）、芽孢杆菌（Bacillus）和B-42 属的丰度值均高于其余2 个处理组，其中，假单胞菌属、链霉菌属和芽孢杆菌属的细菌多为生物防治中使用的益生菌，说明微生物菌肥的使用提高了土壤中传统益生菌的比例。

2.3.2 真菌群落在属水平上的丰度变化 5 个土壤样品中检测出的总丰度值在0.5%以上的属共有5个（图7，8），其中，子囊菌门有4 个属，担子菌门有1 个属；总丰度值在1%以上的只有足孢子菌属（Podospora）和嗜热真菌（Mycothermus）。

从图7 可以看出，B 的丰度值均低于A，足孢子菌属的丰度值降低为0，说明敌磺钠对于真菌属水平的影响较大；而由图8 可知，足孢子菌属在MF中丰度值最高，CK 中最低，其余属在3 个处理组中差异很小，施肥处理对真菌群落在属水平上的变化存在一定影响。

3 结论与讨论

健康土壤中的微生物群落结构处于一种良好的平衡状态，单一作物的连续种植导致土壤结构发生改变，进而导致土壤中微生物群落发生变化，有益微生物处于劣势，而有害微生物则占据了优势，尤其是土壤中病原真菌的比例会大大增加[12]。

3.1 敌磺钠对于土壤微生物多样性的影响

敌磺钠是一种常用的土壤土传病害的杀菌剂[21-22]，本研究结果表明，敌磺钠对于土壤真菌的多样性影响要远远大于对于细菌多样性的影响。从多样性指数分析，经过敌磺钠处理后的草莓连作土壤，真菌的Shannon 指数和Chao1 指数都显著降低。这与张庆华等[15]施用棉隆消毒后土壤真菌群落丰度及其生物多样性均下降的研究结果相似。敌磺钠对于细菌多样性的影响结果表明，处理后细菌的Shannon 指数降低，而Chao1 指数反而上升。伍朝荣等[23]研究表明，在厌氧消毒法处理土壤后，其细菌的Chao1 指数反而升高，而Shannon 指数略有降低，其结果与本研究相类似。

敌磺钠对细菌在门分类水平上的组成没有显著影响，在丰度值上有一定改变，而且变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和[thermi]门在敌磺钠处理之后丰度值升高。敌磺钠对于真菌群落在门分类水平组成的影响很大，敌磺钠处理之后土壤中真菌门有3 个丰度值为0，子囊菌门的相对丰度值还大大增加，占到了99.20%。这与张庆华[15]的试验结果一致，棉隆处理后，只有子囊菌门的丰度值增加，但是并没有增加很多，由40.91%增加至57.25%。土壤经过处理之后，真菌的种类和多样性都大大降低。

在属水平上，敌磺钠处理后，有2 个细菌属的丰度值为0，有7 个属的丰度值升高；仅有1 个真菌属的丰度值成为0，没有属的丰度值升高。在杀菌能力上，敌磺钠对于真菌具有很强的针对性。

综上所述，敌磺纳处理后，土壤微生物多样性发生了极大的改变，几乎处于一种类似“真空”的状态[15]，可以说达到了处理土壤的目的。但是这样的土壤并不适合进行植株的种植，还需要通过一些方法调节土壤的微生物群落才可以达到农业生产的要求。

3.2 不同施肥方式对土壤微生物的影响

土壤进行消毒处理之后，需要对土壤进行恢复性调节，本试验采用了有机肥和微生物肥2 种施肥方式进行土壤微生物调节。

研究表明，不同类型外源有机物的投入对土壤微生物种群数量及其群落结构的影响存在着显著性差异[24-26]。施用有机肥或者微生物有机肥不仅可以增进土壤肥力，而且能改善作物根系微生态环境中的理化性状，从而提高有益微生物活性及作物的抗病能力[27]。

本试验发现，有机肥和微生物菌肥的施用提高了细菌的多样性，降低了真菌的多样性，符合健康的“细菌型”土壤的标准。说明有机肥和微生物肥都能够有效地改良土壤环境。这与很多研究结果一致，付琳[28]在试验中发现，微生物肥改变了香蕉根际土壤细菌和真菌的群落组成，降低了根际土壤中真菌的丰度并增加了细菌的丰度和多样性。朱菲莹等[29]研究表明，棉隆＋生物有机肥的处理组中土壤细菌多样性最高，而且芽孢杆菌属Bacillus 的丰度值也是最高的，对西瓜枯萎病防治效果最好。

在门水平组成分类上，草莓根际土壤的优势细菌门为变形菌门和放线菌门，而子囊菌门则是真菌中的优势门，丰度值占绝对比例。微生物肥处理组有6 个细菌门（变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、[thermi]门和蓝藻门）的丰度值最高；有机肥处理组有4 个细菌门（浮霉菌门、拟杆菌门、酸杆菌门和od1 门）最高；对照组只有2 个细菌门（芽单胞菌门和疣微菌门）的丰度值最高。真菌门水平则因为子囊菌门的绝对优势，导致其他的真菌门丰度值都很低。肥料的施用对于细菌门水平的影响要大于真菌门水平的影响，而微生物菌肥的影响又大于有机肥的影响。

在细菌的属水平上，微生物肥处理后，有7 个属的细菌丰度值要高于有机肥组和对照组，其中包括假单胞菌属、链霉菌属和芽孢杆菌属，而这3 个属的细菌大多是有益菌。付琳等[28]研究也证实，微生物肥的加入提高了根际细菌群落的丰富度和多样性，并诱导了巨大芽孢杆菌、荧光假单胞菌和放线菌的富集。朱菲莹等[29]研究证实，在棉隆＋生物有机肥的处理组中，土壤细菌多样性最高，而且芽孢杆菌属的丰度值也是最高的，对西瓜枯萎病防治效果最好。可以说微生物肥的加入使得土壤中有益细菌的丰度值增加，更容易发挥生物防治的效果，比起其他2 种肥料来说，改良土壤环境的能力更强。与此相反，真菌群落在属水平上的变化并不明显，其中，足孢子菌属在微生物肥处理后丰度值最高，其余的4 个属均是对照组的丰度值最高。

3.3 连作土壤处理的最佳组合

本研究针对草莓连作土壤的处理分为2 步，首先采取化学手段进行土壤杀菌，草莓土传病害主要是真菌性病害[30]，所以敌磺钠的施用对于真菌有效果良好；其次采用有机肥和微生物肥料进行土壤微生物以及根际土壤群落结构的调节，结果发现，效果最好的是微生物肥，经过处理后土壤的真菌多样性降低，细菌的多样性提高，同时，有益菌包括假单胞菌属[31]、链霉菌属[32-33]和芽孢杆菌属[34]在草莓的根际成功定殖，将连作土壤恢复成适合草莓植株生长的土壤环境。张庆华等[15]研究认为，采用棉隆和添加生物菌肥相结合的方式可为草莓根际微生物（真菌群落）提供更有利的生长环境，也为土传病害的有效防治和生物菌肥高效利用提供理论依据，其研究结论与本研究基本一致。朱菲莹等[29]研究也认为，棉隆对土壤熏蒸消毒的作用加上生物有机肥施用后对土壤生态系统的重建（尤其是细菌群落结构），有利于西瓜植株的健康生长。

连作土壤的处理是一个需要结合多种手段的综合治理过程，目前使用较多的方法就是先治再调，也取得了一定的效果，微生物群落多样性的分析有助于了解土壤在受到外界干扰时内部的结构变化，帮助我们了解处理手段的优劣，从而找到合适的处理手段。但是，土壤环境的复杂性决定了其受多种因素所调节[35]，所以，还需要进行很多更加深入透彻的研究，才能为综合治理提供科学依据。