辛志敏，杨晓葵，余兰，宋蕊，王芹，王树玉

(首都医科大学附属北京妇产医院生殖科，北京 100026)

随着胚胎培养基的改善，使卵裂期胚胎移植逐渐趋向于囊胚期移植。将移植日推迟到较晚的阶段可以更好地进行胚胎选择，并可能显著提高着床率和降低多胎率[1]。在体内，胚胎在发育的第4天从输卵管进入子宫，这个时期已被证明是哺乳动物胚胎发育的一个关键窗口。在这个阶段，胚胎已经融合，而且也激活了自身的基因组，使精确的体内平衡控制成为可能。但是，同取卵后第五天移植相比，第四天移植的胚胎在体外少培养一天，这是否会对胚胎的筛选优化产生不利影响？因此，本文回顾性分析了第4天桑葚胚或第5天囊胚移植对妊娠结局的影响，进一步探讨第4天桑葚胚移植的可行性。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2016年1月至2016年12月在首都医科大学附属北京妇产医院生殖科行IVF-ET治疗的患者资料。

纳入/排除标准：(1)女方基础FSH水平<10 U/L；(2)女方体重指数(BMI)<28 kg/m2；(3)夫妇双方染色体检测均正常；(4)女方无子宫畸形、子宫内膜异位症、单侧或双侧输卵管积水及其他免疫性不孕或内分泌疾病；(5)胚胎发育天数为 D4 或 D5。

共纳入182例患者的182个周期。其中桑葚胚移植组(D4 组)102个周期，囊胚移植组(D5组)80 个周期。

二、研究方法

1.控制性超排卵：按本中心常规促排卵方案进行，Gn启动剂量根据患者年龄、基础FSH水平、窦卵泡数和既往促排卵卵巢反应情况决定，启动后根据卵巢反应情况调整剂量。当有1个卵泡直径≥18 mm或2个卵泡直径≥17 mm时注射HCG(艾泽，默克雪兰诺，瑞士)250 μg，HCG后34～36 h阴道B超引导下穿刺取卵。

2.胚胎培养与移植：卵子及胚胎的培养采用澳大利亚COOK系列序贯培养基，精液处理采用上游法。获得的卵冠丘复合物体外培养4～6 h后行常规IVF受精，受精后16～20 h观察原核情况，出现两原核(2PN)为正常受精。取卵后D4或D5选择优质桑葚胚或囊胚行胚胎移植，移植术后予以黄体支持。

3.胚胎质量评估：第4天的评分系统参照Tao等[2]评分系统标准(1～4级)：4级胚胎被认为是最好的，胚胎为几乎完全融合的；3级胚胎呈球形，75%以上的卵裂球融合，碎片<25%；2级胚胎形状不规则，50%左右的卵裂球融合，25%<碎片<50%；1级是最差的，1级桑葚胚显示不到30%的卵裂球处于融合过程中，碎片>50%。最佳的桑葚胚为卵裂球融合率超过75%的胚胎，3级和4级定义为优质桑葚胚。第5天的胚胎评分参考Gardner囊胚评分系统[3]，优质囊胚定义为4BB以上的囊胚。

4.观察指标：胚胎移植术后14 d查血β-HCG>5 U/L确定为妊娠试验阳性。移植后35 d行B超检查见孕囊及胎心搏动确定为临床妊娠。

主要观察指标及各种率的计算方法：种植率=种植胚胎数/移植胚胎数×100%，临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%，异位妊娠率=异位妊娠数/临床妊娠数×100%，流产率=(早期流产数+晚期流产数)/临床妊娠数×100%，足月分娩率=足月分娩数/分娩周期数×100%，活产率=活产的分娩数/移植周期数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、两组一般情况比较

两组患者年龄、不孕年限、基础FSH水平、Gn天数和用量、HCG日E2水平、HCG日内膜厚度和获卵数差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

二、两组患者妊娠结局比较

比较两组患者平均移植胚胎数、胚胎植入率、临床妊娠率、流产率、活产率及足月分娩率和异位妊娠率均无显著差异(P>0.05)(表2)。

组 别周期数平均移植胚胎数胚胎植入率临床妊娠率D4组1021.80±0.3234.52(68/197)45.09(46/102)D5组801.79±0.2835.33(53/150)48.75(39/80)组 别周期数流产率活产率足月分娩率异位妊娠率D4组10219.56(9/46)36.27(37/102)86.48(32/37)0(0/46)D5组8015.38(6/39)41.25(33/80)81.82(27/33)0(0/39)

讨 论

在IVF-ET周期中，选择最有发育潜能或整倍体的胚胎进行移植是提高临床妊娠率的前提。序贯培养系统的发明有效地弥补了单一培养液的不足，使获得高质量囊胚进行移植成为现实，这无疑在很大程度上提高了ART的成功率。囊胚移植改善了胚胎-子宫内膜的同步性，同时由于囊胚染色体异常比例下降，因此有更多的机会选择合适的胚胎进行移植[4-5]。然而，至今仍缺乏有效的指标判断卵裂期胚胎发育成囊胚的能力，即使使用目前最先进的序贯培养基，第5天胚胎移植仍然存在因胚胎发育阻滞或囊胚质量差而取消移植的潜在风险。Montag等[6]的研究表明，在发育后期没有胚胎选择的情况下，延长胚胎培养是无益的，囊胚移植会增加移植的周期取消率、降低累积妊娠率。

在IVF-ET周期中，大部分移植的是卵裂期胚胎或囊胚，很少尝试第4天桑椹胚的移植。卵裂期的优质胚胎有60%可能为非整倍体，而发育到桑葚胚及囊胚的非整倍体率可降低到30%左右[7]。研究发现，在胚胎发育的早期阶段即在受精第3天之前，胚胎基因组转录处于沉默状态，多数胚胎的合子基因组尚未被激活[8]。而在胚胎基因组活化后，细胞凋亡系统和细胞周期检查点才可能被激活，从而导致桑椹胚到囊胚阶段嵌合体胚胎的减少。Hsieh等[9]的研究亦表明在第4天与第5天胚胎中观察到更高的整倍体率。另外，胚胎过早暴露于子宫环境不符合生理状态，尤其是经过卵巢刺激后高雌激素状态的子宫内膜。在体内，胚胎是经过输卵管进入宫腔，进入宫腔时已发育到桑椹胚阶段。因此，第4天桑椹胚移植比第2天或第3天移植更接近生理过程。此时子宫的蠕动也明显的减少，有利于胚胎的植入。由于胚胎着床发生在受精后 6～7 d，卵裂期移植的胚胎距离子宫内膜的窗口期较远，与正常生理情况相差较大，但桑葚胚与第5天移植的囊胚时间较为接近，也可能是本研究结果妊娠率无明显差异的原因。桑葚胚阶段还有一些其他积极的方面。例如，辅助孵化更容易也更安全。因为胚胎在融合过程中有一个较大的卵周间隙，相比而言可以降低囊胚期辅助孵化的风险；与第5天相比，第4天胚胎移植可缩短在体外培养的时间，而胚胎体外培养时间的延长可能会导致基因后天修饰的异常(基因印记异常)，进而可能影响胚胎的发育及分化过程。另外，将胚胎延长培养至囊胚阶段最大的问题就是囊胚发育的不可预测性，从而显著增加了胚胎丢失的风险。在囊胚培养时不能形成可利用囊胚的胚胎，如果在桑葚胚期将其移植，其在体内环境中可能会继续发育并成功着床[10]。

目前，胚胎形态学评分仍然是最广泛应用的胚胎选择方法。尽管卵裂期胚胎(第2天和第3天)和囊胚期胚胎(第5天和第6天)的分级系统已被广泛接受，但第4天桑葚胚期的分级仍然不一致和不确定。到目前为止，关于这一阶段胚胎分级的研究还很少。在20世纪早期，Tao等[2]在第4天移植桑葚胚后患者成功怀孕。Fabozzi等[11]也提出了一种桑葚胚评分系统，观察两个简单的参数(融合和碎片)来检验桑椹胚形态是否可以预测囊胚发育和囊胚质量，结果证明第4天的胚胎选择可以替代卵裂期或囊胚阶段的选择[12]。Tao等[2]的研究发现，移植第3天胚胎与第4天桑葚胚的妊娠率无明显差异，且第4天胚胎持续妊娠率高于第3天[7]。对第4天和第5天单胚胎移植的研究表明：两组之间的临床妊娠率没有显著差异[13-16]，但囊胚移植有助于筛选出最具发育潜能的胚胎，单囊胚移植仍然是试管婴儿治疗领域发展趋势。

影响IVF-ET胚胎生长与妊娠结局的因素较多，主要包括女方年龄、不孕时间、移植日子宫内膜厚度等。本研究中两组年龄、不孕年限及移植日子宫内膜厚度等比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。获卵数是影响IVF-ET妊娠结局的重要因素，理想的获卵数可避免卵巢过度刺激综合征，获得较好的妊娠结局。本研究两组患者获卵数比较，差异亦无统计学意义(P>0.05)。

本研究结果表明，第4天移植组和第5天移植组的平均移植胚胎数、优质胚胎率、种植率、临床妊娠率、活产率、足月分娩率及异位妊娠率均无显著差异(P均>0.05)，与Li等[14]研究结果不同的是其研究显示两组之间足月分娩率有显著差异(P<0.05)，两组足月分娩率的差异可能与第4天移植组缩短胚胎体外培养时间有关，也可能是由于研究设计和选择的患者人群之间的差异造成的。Glujovsky等[17]关于4项随机对照试验的Meta分析显示，与囊胚相比，卵裂期胚胎移植的累积妊娠率显著增加。随着延长培养累积活产率降低的可能原因是：未形成囊胚的胚胎由于没达到移植或冷冻标准被丢弃，但如果其在胚胎阶段冷冻并在解冻后成功移植，则有临床妊娠的可能。这意味着在体外培养中使胚胎损耗最小化可能导致更多怀孕的可能性，累积妊娠率也更高。本研究中由于部分患者尚未解冻剩余保存胚胎，我们未对纳入的研究对象进行累计妊娠率的统计，考虑到如果进一步观察随访，有可能得到有意义的临床结局。

目前，单囊胚移植是一种发展趋势[18]。本研究结果提示，第4天桑葚胚移植可能是另一种选择，这一策略在不影响临床妊娠率的情况下，具有第4天或第5天移植的灵活性。如果由于部分患者自身的特殊情况或者第5天移植会造成IVF实验室的非最佳培养条件(如IVF-ET周期过多或其他囊胚培养非最优)，第4天移植桑葚胚也是一种可行的选择。