左娅薇，莫春柏，李光，耿洁，王玉亮△

器官移植已成为治疗多种器官终末期疾病的最有效手段。尽管近年来随着器官保存、组织配型技术的发展，以及新型免疫抑制剂的广泛应用，肾移植患者所移植肾脏短期存活率获得很大的提高，但远期效果并没有得到相应的改善。急性排斥是导致移植肾功能丧失的最主要的因素之一［1］。肿瘤坏死因子受体超家族成员-OX40（CD134）作为一种共刺激分子，对于维持CD4+T细胞的活化、增殖、存活以及记忆T细胞的形成起到关键作用［2］。本研究探讨肾移植急性排斥患者外周血单个核细胞（PBMCs）中OX40 mRNA表达水平以及外周血CD3+CD8-T辅助细胞（Th）1、Th2在预测肾移植急性排斥反应中的应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2016年1月—2017年1月在天津市第一中心医院器官移植中心接受肾移植手术的急性排斥受者20例，男14例，女6例，平均年龄（43±10）岁。急性排斥反应诊断标准：尿量减少，发热（体温可＞38℃），血压升高，实验室检查肌酐升高、蛋白尿、尿比重下降，尿脱落细胞检查发现集合小管、核残余细胞碎片及纤维蛋白原沉着增多，彩超显示移植肾体积增大、血流减少、血管阻力增加。另选取同期术后肾功能稳定受者20例为肾功能稳定组，男13例，女7例，平均年龄（40±12）岁。肾功能稳定判断依据：术后7 d内移植肾功能恢复正常，B型超声检查显示移植肾体积、结构和血流均正常。以20例本院健康志愿者作为对照组，男15例，女5例，平均年龄（44±11）岁。所有研究对象均签订知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司），TRIzol RNA提取试剂（美国Invitrogen公司），引物及TaqMan荧光探针（美国Applied Biosystems公司），抗人CD3-PE-Cy5、CD8-FITC、IFN-γ-PE和IL-4-PE单克隆抗体（美国eBioscience公司），FACS溶血素、FACS通透液（美国BD公司），佛波酯、离子霉素、莫能酶素（美国Sigma公司），RPMI 1640培养液、胎牛血清（美国Gibco公司），ABI 7500实时荧光定量PCR扩增仪（美国Applied Biosystems公司），FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 方法

1.3.1 OX40 mRNA水平检测 清晨采集研究对象的空腹外周静脉血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝。用淋巴细胞分离液密度梯度离心法常规分离PBMCs。TRIzol法提取细胞总RNA。按逆转录酶说明书操作合成cDNA，产物于-80℃保存。OX40引物上游 5′-ACGACGTGGTCAGCTCCAA-3′，下游5′-TCCGCTCACTCCCACTTCTG-3′，探针序列：5′-FAMAAGCCCTGCACGTGGTGTAACC-TAMRA-3′；内参基因βactin 引物上游 5′-GATGGCCACGGCTGCTT-3′，下游 5′-ACCGCTCATTGCCAATGGT-3′，探针序列：5′-FAMCTACGAGCTGCCTGACGGCCAGG-TAMRA-3′。荧光定量PCR反应条件：50℃ 2 min；95℃ 5 min；95℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃1 min，共35个循环。在PCR反应结束后，设定基线水平和阈值，仪器自动绘制标准曲线，并根据标准曲线计算各样本基因拷贝数［3］。

1.3.2 Th1、Th2细胞因子检测 将1 mL肝素抗凝血加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基1 mL混匀，然后加入佛波酯（25 ng/mL）、离子霉素（1µmol/L）刺激剂，及蛋白质转运抑制剂莫能酶素（2µmol/L），将培养瓶置于培养箱，37℃、5%CO2培养4 h。将刺激好的标本加入Falcon管中，200µL/管。加入20µL胞外抗体CD3-PE-Cy5和CD8-FITC混匀，室温避光15 min，经洗涤、固定、通透细胞后样品管加入胞内染色的抗体（IFN-γ-PE和IL-4-PE）10µL，对照管中加入相应的同型对照10µL，混匀，室温避光30 min并洗涤后，以1%多聚甲醛悬浮细胞，流式细胞仪分析测定CD3+CD8-T淋巴细胞中IFN-γ（Th1）和IL-4（Th2）表达率。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，绘制受试者工作特征（ROC）曲线评价OX40及Th1的预测价值并计算ROC曲线下面积（AUC），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PBMCs中OX40 mRNA表达水平 肾移植术后急性排斥组PBMCs中OX40 mRNA表达水平明显高于肾功能稳定组和健康对照组，差异有统计学意义（F=27.005，P＜0.01），肾功能稳定组 PBMCs中OX40 mRNA水平与健康对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）；见图1。TaqMan实时荧光RT-PCR检测样本OX40扩增曲线见图2。

2.2 Th1、Th2表达率 急性排斥组Th1表达率（14.6%±7.3%）明显高于肾功能稳定组（8.5%±4.1%）和健康对照组（9.8%±4.2%），差异有统计学意义（F=7.026，P＜0.01）。3组患者Th2表达率差异无统计学意义（F=1.207，P＞0.05）；见图3。Th细胞流式结果见图4。

Fig.2 PCR positive amplification curve of OX40图2 OX40 PCR阳性标本扩增曲线

Fig.3 The expression percentage of Th1 and Th2 in three groups图3 各组Th1、Th2细胞表达率

2.3 ROC曲线分析 OX40 mRNA诊断急性排斥反应的 ROC 曲线下面积（AUC）为 0.903（95%CI：0.825～0.980）；Th1诊断急性排斥反应的ROC曲线下面积（AUC）为 0.731（95%CI：0.587～0.874）；OX40 mRNA联合Th1诊断急性排斥反应的ROC曲线下面积（AUC）为0.930（95%CI：0.859～1.001）；见图5。

3 讨论

3.1 OX40生物学特性 移植排斥反应的本质是体内免疫系统对外来抗原的免疫应答，受体T细胞作为同种异体免疫排斥反应的主要效应细胞，其活化需要“双信号”刺激。第一信号包括T细胞接受抗原递呈细胞提供的外来抗原，第二信号则是共刺激信号通路。OX40作为促进T淋巴细胞活化、增殖和细胞因子分泌的共刺激信号之一，主要在活化的CD4+T细胞表面表达，对于维持CD4+T细胞的活化、增殖、迁移,促进生发中心的形成和树突状细胞（DC）的分化成熟起到关键作用。在小鼠中OX40在调节性T细胞（Treg）上表达，然而，在人类中OX40表达在外周血Treg上低表达或不表达，但在从炎症部位（例如恶性肿瘤）分离的Treg中表达较高。OX40配体（OX40L）主要存在于活化的抗原呈递细胞（例如树突细胞、B细胞、巨噬细胞和内皮细胞）上，但也可以表达在活化的T细胞表面。OX40/OX40L共刺激信号通路主要在免疫应答的后期起维持和调节共刺激信号的作用，上调IL-2的表达，促进T细胞的活化、增殖和细胞因子分泌，能打破外周免疫耐受，延长T细胞的存活时间［4-5］。本研究结果显示，急性排斥受者PBMCs中OX40 mRNA表达水平明显高于肾功能稳定受者，肾移植受者术后服用免疫抑制剂可使机体免疫力受到抑制，OX40分子的低表达抑制淋巴细胞活化，而OX40分子的高表达可促进Bcl-2、Bcl-xL等一系列抗凋亡分子高表达，从而减少T细胞凋亡并维持CD4+T细胞的存活，进一步促进CD4+T细胞穿过血管内皮在炎症位点的募集［6］，因此，肾移植术后PBMCs中OX40 mRNA表达水平在一定程度上可以反映受者当前的免疫状态。

Fig.4 Flow cytometry of Th cells图4 Th细胞流式细胞图

Fig.5 ROC curves of OX40 mRNA and Th1 for predicting acute rejection图5 OX40 mRNA及Th1预测急性排斥的ROC曲线

3.2 Th细胞亚群 细胞因子作为T细胞分泌的具有生物活性的成分，具有通过结合相应受体来调节T细胞分化、调控免疫应答等多种作用。研究证实，肾移植术后发生细胞介导的急性排斥反应是一种Th1型细胞因子占优势的免疫反应，而Th2型细胞因子可以诱导移植物形成免疫耐受，利于移植物长期存活。大量研究证实，检测移植术后Th细胞对于了解移植受者术后免疫功能状态以及免疫抑制剂合理应用具有一定意义［7-8］。本研究结果显示，肾移植术后急性排斥受者外周血中CD3+CD8-T淋巴细胞中IFN-γ表达率较肾功能稳定受者显著升高，而CD3+CD8-T淋巴细胞中IL-4表达率与肾功能稳定受者相比差异无统计学意义。IFN-γ主要由活化的T细胞和自然杀伤（NK）细胞产生，能促进Th0细胞分化为Th1细胞，并抑制Th2细胞增生，激活中性粒细胞功能和NK细胞、巨噬细胞杀伤活性，同时激活的T细胞还可诱导抗原呈递细胞（APC）产生IL-12，进一步上调IFN-γ［9］，是急性排斥反应的重要介质，其促炎功能提示Th1而不是Th2细胞在排斥反应发生发展中发挥重要作用［10］。

3.3 OX40 mRNA、Th1细胞联合检测 目前在肾移植领域及时、准确地预测急性排斥反应仍是移植中心的重要研究方向。本研究进一步对检测指标行ROC分析，结果表明OX40 mRNA、Th1细胞对预测诊断急性排斥反应的AUC值分别为0.903和0.731，两者联合预测急性排斥反应的AUC值提升至0.930，这提示联合检测这两个指标对预测肾移植术后急性排斥反应诊断价值较高。进一步特异性阻断该OX40/OX40L共刺激信号通路将有利于诱导免疫耐受［11］。

综上所述，肾移植术后急性排斥患者共刺激分子OX40水平上调同时引起Th1增加，监测肾移植受者外周血OX40 mRNA及Th1可以预测急性排斥反应。