心肌自噬在异丙肾上腺素诱导心肌肥厚中的作用

2019-08-16宋代富郭国锋龙海权陈盛强黄炯华陈晞明

天津医药 2019年7期

宋代富，郭国锋，龙海权，陈盛强，黄炯华△，陈晞明△

心肌肥厚是心脏应对各种因子长期刺激所致心力衰竭的早期病理过程。既往研究证实，心肌肥厚患者心房纤颤、恶性心律失常、心源性猝死的发病风险明显升高［1］。虽然肾素-血管紧张素-醛固酮系统轴抑制剂和β-受体阻滞剂在心肌肥厚向心力衰竭进展早期有良好的抗心肌肥大效应，但无论是单用或合用这两类药物均不能完全逆转病理性心肌肥厚的进展，患者并发心衰入院率仍很高［2］。随着研究深入，一些通过降低压力负荷延缓心肌肥厚进展的技术及器械装置正用于临床试验［3-5］，而其安全性和有效性仍不明确，是否有临床应用前景尚不清楚。究其原因是目前对心肌肥厚的分子生物学发病机制尚不明确，防治心力衰竭的手段仍有限。因此，延缓或逆转病理性心肌肥厚有望成为防治心力衰竭的新策略与靶点。近年来动物体内外研究证据显示，病理性心肌肥厚存在心肌自噬的异常改变［6-7］，笔者既往研究结果提示，调控自噬有望成为逆转心肌肥厚、防治心力衰竭的新策略［8］。然而，自噬在病理性心肌肥厚中的具体作用尚未明确。目前，尚鲜见通过自噬诱导药物治疗异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）介导病理性心肌肥厚的相关研究。为此，本研究旨在通过诱导动物体内心肌自噬的改变，明确自噬在ISO介导心肌肥厚中的作用，为药物靶向自噬逆转病理性心肌肥厚和防治心力衰竭提供实验基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料体质量180～220 g的SPF级SD大鼠29只，购自南方医科大学实验动物中心。ISO购自上海TCI公司、水合氯醛购自天津市大茂化学试剂厂，雷帕霉素（rapamycin，RAP）购自LC Laboratories公司，SQSTM1/p62、LC3和β-actin抗体购自英国Abcam公司；细胞裂解液NP-40、辣根过氧化物酶标记的二抗购自上海碧云天公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；HE和Masson染色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。主要仪器：动物心脏彩超仪（ie33型号）及7.5 MHz高频线控探头购自荷兰PHILIPS公司；病理切片显微镜购自德国Leica公司，蛋白电泳仪及Western发光试剂购自Bio-Rad公司，透射电镜检测仪购自日本日立公司。

1.2 实验分组将29只大鼠随机数字表法分为3组：（1）对照（Con）组9只。皮下联合腹腔注射生理盐水。（2）ISO组10只。皮下注射ISO，注射剂量参照文献［9-10］，联合腹腔注射生理盐水。（3）ISO+RAP组10只。皮下注射ISO，联合腹腔注射RAP，注射剂量参照文献［11］。干预治疗14 d，将存活各组大鼠（Con组，n=9；ISO组，n=8；ISO+RAP组，n=10）进行下一步实验检测。

1.3 心脏超声仪检测左室壁厚度和左室射血分数在异氟烷麻醉下，备皮，应用超声心动仪检测Con组和ISO组大鼠左心室舒张末期前壁厚度（left ventricular anterior wall enddiastolic thickness，LVAWd）、左心室收缩末期前壁厚度（left ventricular anterior wall end-systolic thickness，LVAWs）、左心室舒张末期后壁厚度（left ventricular posterior wall enddiastolic thickness，LVPWd）、左心室收缩末期后壁厚度（left ventricular posterior wall end-systolic thickness，LVPWs）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF），评价ISO构建病理性心肌肥厚的模型效果。超声检查主要目的是为了实时动态检验ISO诱导心肌肥厚效果，且为了更加客观地评价心肌肥厚改变，笔者进一步采用微观病理切片和心脏体质量指数，故ISO+RAP组未使用主观性较强的超声检查。

1.4 获取心脏组织计算心脏体质量指数（heart weight/body weight index，HWI）完成超声心动图后，每只大鼠称体质量（body weight，BW）后以腹腔内注射过量的10%水合氯醛处死，开胸，剪取大鼠心脏置入预冷磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗数次，迅速用滤纸吸干PBS后称心脏质量（heart weight，HW），计算HWI（HWI=HW/BW）。

1.5 显微镜观察心肌组织病理变化获取心脏用10%福尔马林固定，石蜡包埋，心脏横向切片（6µm），常规苏木精＆伊红（HE）及Masson染色。组织切片显微镜（HE染色，×400；Masson染色，×5）观察并拍照。

1.6 Western blot检测自噬活性标志蛋白变化采用NP-40裂解液抽提心肌组织总蛋白并通过BCA法测定蛋白浓度。取40µg蛋白进行电泳分离和转膜。将承载有目的蛋白的PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭1 h，加入抗体p62（1∶6 000）、LC3（1∶5 000）和β-action于4℃孵育过夜。孵育过夜的蛋白膜用PBS-Tween 20洗涤后加入免疫二抗进行免疫共沉淀反应。免疫复合物曝光获取底片。使用Image J 18.0进行分析，各蛋白表达量用内参蛋白β-actin标准化。

1.7 透射电镜观察心肌组织自噬泡每组随机选3只大鼠取左室心肌组织约1 mm×1 mm×1 mm，置入预冷电镜固定液（2.5%戊二醛），室温2 h后转4℃冰箱固定12 h，取出标本用PBS漂洗后2%锇酸固定2 h，环氧树脂包埋后，每只大鼠随机抽取1张切片，采用扫描电镜任意读取3个不同视野计数自噬泡数量，即每组共9个不同视野下自噬泡的数量。

1.8 统计学方法采用SPSS 16.0软件进行统计学处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较用LSD-t法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ISO组与Con组大鼠左室结构和功能变化的比较与Con组比较，ISO组的LVAWd、LVAWs、LVPWd、LVPWs和LVEF均增大（P＜0.01），见表1。

Tab.1 Comparison of the left ventricular wall thickness and LVEF between Con group and ISO group表1 Con组与ISO组组左室壁厚度和射血分数的比较（±s）

＊＊P＜0.01

组别Con组ISO组t n7 8 LVAWd（10-3cm）178.14±20.33 265.14±30.86 6.338＊＊LVAWs（10-3cm）291.07±29.62 441.17±37.31 8.535＊＊组别Con组ISO组t n7 8 LVPWd（10-3cm）165.29±21.52 230.84±21.21 5.925＊＊LVPWs（10-3cm）273.32±17.60 389.99±32.71 8.407＊＊LVEF 0.75±0.06 0.91±0.05 5.452＊＊

2.2 各组心脏体质量指数变化情况比较与Con组比较，ISO组和ISO+RAP组HW增加、BW减轻、HWI增加（均P＜0.01）；与ISO组比较，ISO+RAP组的HW下降、BW减轻、HWI减小（均P＜0.01），见表2。

2.3 各组心肌组织病理变化与Con组比较，ISO组和ISO+RAP组心肌组织横切面Masson染色可见心内膜纤维化明显，室壁增厚，心腔变小，向心性肥厚明显，而局部组织HE染色可见心肌细胞肥大、细胞核混乱、染色不均、心肌纤维化增多；与ISO组比较，ISO+RAP组病理性心肌肥厚特征明显改善，见图1。

Tab.2 Comparison of heart weight/body weight index between three groups表2 3组大鼠心脏体质量指数的比较（±s）

＊＊P＜0.01；a与Con组比较，b与ISO组比较

组别n HW（g）BW（g）HWI（%）Con组ISO组ISO+RAP组F 9 8 1 0 0.88±0.04 1.30±0.07a 0.97±0.08ab 96.910＊＊312.00±12.94 285.88±12.88a 234.80±19.30ab 60.314＊＊0.28±0.01 0.45±0.03a 0.41±0.01ab 189.320＊＊

2.4 各组心肌自噬活性比较与Con组比较，ISO组LC3Ⅱ/Ⅰ比值下调，而p62表达上调（P＜0.01）；与ISO组比较，ISO+RAP组LC3Ⅱ/Ⅰ比值上调，而p62表达下调（P＜0.01），见表3、图2。

Tab.3 Comparison of the ratio of LC3Ⅱ/Ⅰ and the expression level of p62 in cardiac tissues between the three groups表3 各种心肌组织LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62相对表达水平的比较（±s）

＊＊P＜0.01；a与Con组比较，,b与ISO组比较

组别n LC3Ⅱ/Ⅰp62 Con组ISO组ISO+RAP组F 3 3 3 1.00±0.04 0.43±0.10a 1.00±0.24b 14.225＊＊1.00±0.29 1.80±0.22a 0.71±0.09b 21.095＊＊

2.5 各组心肌组织自噬泡数量比较 Con组、ISO组、ISO+RAP组的心肌组织自噬泡数量分别为（1.44±0.51）个、（0.56±0.20）个及（2.89±0.51）个，组间差异有统计学意义（n=3，F=22.315，P＜0.01），其中ISO组较Con组的心肌组织自噬泡数量明显减少（P＜0.05），ISO+RAP组较ISO组的心肌组织自噬泡数量显著增多（P＜0.01），见图3。

Fig.1 The pathological morphology of cardiac tissues for three groups图1 各组心肌组织病理形态

Fig.2 Comparison of the ratio of LC3Ⅱ/Ⅰand the expression level of p62 in cardiac tissue between the three groups图2 各组大鼠心肌组织LC3和p62蛋白表达水平

3 讨论

β肾上腺素能受体与儿茶酚胺类激素结合而被激活，进而促进心电传导，可提高心率、增强心肌收缩力。在儿茶酚胺类激素的持续作用下，心脏会逐渐出现心肌细胞肥大和心肌纤维化，即心肌肥厚样改变。ISO可激活β肾上腺能受体，通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、鸟苷酸结合蛋白-腺苷酸环化酶-环磷腺苷-蛋白激酶A（G蛋白-AC-cAMP-PKA）通路、Janus激酶/信号转导与转录激活子（JAK/STAT3）信号通路、Ca2+信号通路、氧化应激信号通路、核因子κB（NF-κB）相关通路促进心肌肥厚［12］。本研究结果显示，与Con组比较，ISO组的大鼠左室壁厚度增加、LVEF升高、HWI增高、心肌组织呈肥厚样病理改变，且自噬活性标志蛋白p62表达上调、LC3Ⅱ/Ⅰ比值下调，心肌组织自噬泡数量明显减少，表明ISO可诱导大鼠心肌肥厚，同时抑制心肌自噬的活性，与相关研究结果相近［13］。因此，上调心肌自噬有望逆转ISO诱导的病理性心肌肥厚。近年来，越来越多的证据显示，自噬参与了心肌肥厚的发生和发展，自噬调控有望成为逆转心肌肥厚的新策略［14-15］。

目前，普遍认为自噬是一种通过清除细胞内错误折叠蛋白质、受损和老化细胞器、并为细胞提供各种养分和能量物质的自我保护机制［16］。越来越多的研究结果显示，基础水平的自噬是维持机体稳态所必需的，自噬的过渡激活或不足均会促进或抑制疾病的发生和发展［17］。然而，自噬在心肌肥厚发生发展过程中的确切作用尚不明确。部分研究认为，心肌细胞自噬在心肌肥厚过程中起保护作用，如心肌特异性过表达DDiT4L或Sestrin1均可增强心肌自噬，改善病理性心肌肥厚和心功能［18-19］。另外，通过上调miR-222或miR-199a靶向抑制心肌自噬活性，诱发和加重心肌肥厚，促进心肌肥厚向心力衰竭转变［20-21］。但也有研究显示，心肌自噬在心肌肥厚中扮演了负面角色。如Li等［22］研究显示，在心肌中过表达ATG5可增强心肌自噬，加重血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大。Huang等［23］证实，肾脏去交感神经节术可通过抑制心肌自噬活性，显著改善自发性高血压大鼠心肌肥厚程度。

本研究结果显示，与ISO组比较，ISO+RAP组心肌自噬标志蛋白p62表达下调、LC3Ⅱ/Ⅰ比值上调，心肌组织自噬泡数量明显增多，且HWI减少、心肌组织病理性肥厚改善，表明RAP诱导心肌自噬可抑制ISO介导的病理性心肌肥厚。同时，本研究结果显示，与Con组比较，ISO+RAP组大鼠的心脏质量有所增加，但较ISO组显著降低；同时ISO+RAP组大鼠体质量也较ISO组显著减少。既往研究表明，RAP可增强心肌自噬，但对大鼠体质量无显著影响［11］。然而也有研究显示。RAP可使大鼠体质量显著减轻［24］。本研究结果表明，ISO+RAP组大鼠体质量虽较ISO组显著减小，但心脏质量减小的程度更大，故ISO+RAP组大鼠HWI较ISO组显著减小。因此，笔者认为RAP可通过增强心肌自噬改善ISO诱导的病理性心肌肥厚。