高建一，张磊，陈天琰，唐彬，李一镭，李婧，胡嘉波

（江苏大学医学院，江苏镇江212013）

外周神经损伤后远端轴突崩解发生Wallerian变性，残存的雪旺细胞从损伤部位释放并协同巨噬细胞共同清除髓鞘碎片，为轴突的再生清除障碍［1］。在修复后期，雪旺细胞重新增殖形成新的Büngner带，引导轴突生长至靶器官并分泌神经营养因子滋养轴突，减少轴突凋亡［2-3］。神经再生修复是一个漫长且复杂的过程，到目前为止，临床上仍没有一种令人满意的疗法。研究发现，绝经后女性在使用雌激素治疗后，其卒中的概率明显下降［4-6］，证明雌激素可作用于除生殖系统外的其他系统，在中枢神经系统中可透过血脑屏障来抑制神经元凋亡［7-9］。雪旺细胞作为外周神经系统中最重要的神经胶质细胞，存在雌激素受体（estrogen receptor，ER）α（ER-α）和β（ER-β）。人体内生物活性最强的雌激素是 17β-雌二醇［10-11］，其不仅能够通过受体配体结合途径发挥作用，还能通过非受体依赖途径保护细胞免受损害［12-13］。与此同时，17β-雌二醇还能延缓肌肉的萎缩并调节运动和感觉功能的恢复［14］。17β-雌二醇能够加速外周神经损伤后神经的再生，但具体通过何种方式尚不清楚。本研究旨在观察外源性17β-雌二醇在体外对雪旺细胞生物活性的影响，从而进一步观察其在体内对大鼠坐骨神经横断性损伤的修复作用及其保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

12只雄性SD大鼠，200 g左右，由江苏大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（苏）2013-0011；将大鼠随机分为17β-雌二醇组和对照组，每组6只。大鼠雪旺细胞RSC96细胞系购自上海恒圆生物科技公司；高糖DMEM、胎牛血清（美国Gibco公司）；17β-雌二醇（美国 Sigma公司）；CCK-8试剂盒（东仁化学科技有限公司）；Transwell小室（美国Corning公司）；兔抗大鼠 ER-α/β一抗（万类公司）；小鼠抗大鼠β-肌动蛋白一抗、兔抗小鼠HRP标记二抗（美国Santa Cruz公司）；羊抗兔HRP标记二抗（杭州联科生物有限公司）；蛋白印迹系列设备（美国Bio-Rad公司）；实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）；Trizol试剂（美国Thermo公司）；反转录试剂盒（大连TaKaRa公司）。

1.2 细胞实验

1.2.1 17β-雌二醇溶液的配制 称取0.054 4 g 17β-雌二醇，加入10 mL无水乙醇，混匀形成20 mmol/L的储存液，再用无水乙醇稀释成1 mmol/L的母液，储存于-20℃。实验时，取母液加入到无血清DMEM中，配成不同浓度的17β-雌二醇溶液。

1.2.2 CCK-8实验检测细胞增殖能力 将RSC96细胞按照10 000个/孔均匀接种于96孔板中，用含1%胎牛血清的DMEM在37℃、5%CO2条件下培养24 h，使细胞贴壁。随后更换为含50、100、200、400 nmol/L 17β-雌二醇的无血清DMEM刺激24 h；按照试剂盒说明加入CCK-8试剂继续孵育1 h；酶标仪检测450 nm处光密度（D）值。选取最适浓度17β-雌二醇用于后续实验。

1.2.3 细胞分组 将细胞分为2组：对照组和17β-雌二醇组。

1.2.4 蛋白印迹检测雪旺细胞ER-α/β蛋白表达将RSC96细胞接种于6孔板中，当细胞生长至80%融合度时更换培养基为无血清DMEM，饥饿12 h。17β-雌二醇组加入含 100 nmol/L 17β-雌二醇的无血清DMEM，对照组更换为等量无血清DMEM，继续刺激24 h。用RIPA裂解液提取总蛋白质；制备10%分离胶和浓缩胶并依照标准方法行SDSPAGE。70 V电泳30 min后加大电压至110 V继续电泳90 min完全分离条带；300 mA湿转120 min至PVDF膜；用5%脱脂奶粉室温封闭2 h；将PVDF膜放入对应的一抗稀释液中（兔抗大鼠 ER-α/β 1∶1 000，小鼠抗大鼠 β-肌动蛋白1∶500，TBST稀释），4℃孵育过夜；次日 TBST洗膜3次，每次15 min；加入二抗（稀释比均为1∶2 000）室温孵育2 h；TBST洗膜3次，每次15 min；最后在暗室曝光显影。

1.2.5 Transwell实验检测细胞迁移能力 在Transwell上室中加入400μL含5 000个RSC96细胞的无血清DMEM，下室加入 600μL含或不含100 nmol/L 17β-雌二醇的10%胎牛血清DMEM，使细胞在37℃、5%CO2条件下迁移24 h；取出上室，PBS洗涤；4%低聚甲醛固定30 min；结晶紫染色10 min；PBS洗涤后用棉签轻轻擦去小室内侧的细胞，风干；在正置显微镜下随机观察5个视野，计数每个视野的细胞并取平均值。

1.2.6 划痕实验检测细胞的伤口愈合能力 将RSC96细胞接种于24孔板，每孔50 000个细胞；当细胞均匀生长成单层后，用小号枪头对每孔进行垂直划痕，此刻记为0 h。立即更换为含或不含100 nmol/L 17β-雌二醇的无血清DMEM继续培养24 h；用 Image J软件测量并计算细胞相对迁移距离。

1.2.7 qRT-PCR检测神经营养因子mRNA表达将RSC96细胞种于6孔板，当细胞生长至80%融合度时更换为无血清DMEM饥饿12 h；17β-雌二醇组加入含100 nmol/L 17β-雌二醇的无血清DMEM，对照组更换为等量无血清DMEM，继续刺激12 h；用Trizol法提取总 RNA，反转录得到 cDNA。通过公式2-△△Ct计算mRNA相对表达强度。扩增反应程序：94℃预变性2min；95℃变性10 s；低于Tm值2～3℃退火30 s；72℃延伸30 s；行25～30个循环。引物序列及其产物长度见表1。

表1 基因引物序列

1.3 动物实验

1.3.1 SD大鼠坐骨神经横断性损伤模型建立 术前禁食禁饮6 h，腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）完全麻醉大鼠，钝性分离臀肌显露右侧坐骨神经。在距梨状肌下缘3 mm左右切除神经3 mm，通过神经末端的收缩形成5 mm缺损距离。将两侧神经断端塞入5 mm长的硅胶管（外径2 mm，内径0.7 mm）中，用9/0无创缝线固定，再用10/0手术线逐层缝合伤口，术后腹腔注射50 000 U青霉素预防感染。饲养环境保持在25℃左右，维持各12 h的明暗交替，动物可自由饮水和进食。17β-雌二醇组在术前1周每天腹腔给药200μg/kg，对照组注射等量生理盐水，术后每3天注射1次。

1.3.2 坐骨神经功能指数（SFI） 让大鼠稳健通过一条100 cm×10 cm轨道尽头的暗室中，行走前仔细在后肢上涂上无毒的手指泥，收集至少5个可测量的脚印。在第7、14、21、28天时分别收集17β-雌二醇组和对照组健侧（N）、患侧（E）的足印。计算公式：SFI=-38.3×（PLE-PLN）/PLN+109.5×（TSE-TSN）/TSN+13.3×（ITE-ITN）/ITN-8.8。其中，PL为足底全长，TS为第一至第五趾的距离，IT为第二、四趾间的距离。

SFI反映外周神经功能的恢复情况，分数-100表示功能完全丧失，而0表示神经功能正常。

1.3.3 水浴实验 准备42℃恒温水，从大鼠患侧脚掌完全浸入水中开始计时，到大鼠脚掌挣扎出水结束计时，每只大鼠重复3次取平均值。

1.4 统计学分析

用GraphPad Prism 5.0软件对所有数据进行统计学分析；实验结果以均数±标准差（±s）表示；两组间数据比较采用t检验；多组间数据比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。体外实验每次设3个平行复孔，每组实验至少重复3次。

2 结果

2.1 17β-雌二醇促进雪旺细胞增殖

CCK-8实验表明，与0 nmol/L相比，50～200 nmol/L 17β-雌二醇能够不同程度地促进雪旺细胞增殖（P均＜0.05）；其中100 nmol/L 17β-雌二醇刺激雪旺细胞增殖能力最强（t=5.236，P＜0.001）。见图1。故选100 nmol/L 17β-雌二醇作为最适浓度进行后续实验。

2.2 17β-雌二醇促进雪旺细胞ER表达

与对照组相比，17β-雌二醇组雪旺细胞 ER-α和ER-β表达明显增加（ER-α：t=4.952，P＜0.01；ER-β：t=7.917，P＜0.01）。见图2。

图1 CCK-8实验检测雪旺细胞增殖能力

图2 蛋白质印迹检测两组雪旺细胞ER-α和ER-β蛋白表达水平

2.3 17β-雌二醇促进雪旺细胞迁移

Transwell实验显示，用 100 nmol/L 17β-雌二醇刺激24 h后，17β-雌二醇组雪旺细胞迁移能力较对照组明显增强（t=9.84，P＜0.001）。见图3。

图3 Transwell实验检测两组细胞迁移能力

2.4 17β-雌二醇促进雪旺细胞伤口愈合

划痕实验结果显示，100 nmol/L 17β-雌二醇刺激雪旺细胞24 h后，细胞损伤愈合距离较对照组明显增加（t=5.049，P＜0.01）。见图4。

图4 划痕实验检测两组雪旺细胞伤口愈合能力

2.5 17β-雌二醇促进雪旺细胞多种神经营养因子mRNA表达

qRT-PCR检测结果显示，用100 nmol/L 17β-雌二醇刺激雪旺细胞12 h后，BDNF（t=2.925，P＜0.05）、CNTF（t=3.615，P＜0.01）、GDNF（t=2.719，P＜0.05）、NGF（t=2.857，P＜0.05）等 mRNA表达明显升高。见图5。

图5 qRT-PCR分析两组雪旺细胞内多种神经营养因子m RNA相对表达量

2.6 大鼠坐骨神经横断性损伤模型的建立

坐骨神经横断性损伤后第1天，大鼠患侧脚趾张开困难，运动功能完全丧失，提示建模成功。见图6。

图6 大鼠坐骨神经横断性损伤模型建立

2.7 17β-雌二醇促进大鼠运动功能恢复

术后第7天，17β-雌二醇组大鼠SFI优于对照组（t=5.143，P＜0.01）。术后第28天，17β-雌二醇组大鼠运动功能恢复情况较对照组明显提高（t=5.612，P＜0.01）。见图7。

图7 两组大鼠坐骨神经功能指数比较

2.8 17β-雌二醇延缓腓肠肌萎缩

腓肠肌宏观观察和腓肠肌相对湿重共同显示，17β-雌二醇组大鼠腓肠肌萎缩程度明显小于对照组（t=3.441，P＜0.05）。见图8。

图8 两组大鼠腓肠肌萎缩程度比较

2.9 17β-雌二醇促进大鼠感觉功能恢复

热水浴实验显示，17β-雌二醇组大鼠对热敏感性要远高于对照组（t=9.707，P＜0.001），表明大鼠感觉功能恢复良好。见图9。

图9 水浴实验比较两组大鼠感觉功能恢复情况

3 讨论

外周神经损伤如果治疗不及时，长期缺失神经的靶器官会逐渐萎缩最终导致功能完全丧失甚至残疾［15-16］。损伤再生需要多种细胞参与，其中雪旺细胞是参与修复最主要的神经胶质细胞。其在损伤后去分化成为一种“修复细胞”迁移至损伤部位并大量增殖，形成 Büngner带引导轴突再生到靶器官［17-18］。目前对外周神经损伤的治疗仍没有一种理想的手段，但激素的运用在神经修复领域展现出新的潜能。

雌激素是体内常见的类固醇类激素，通过受体依赖和非受体依赖途径发挥其生物功效。大量临床实验证明，中枢神经系统对雌激素十分敏感，外源性雌激素的治疗对神经退行性疾病有明显的保护作用［19-20］。不仅如此，脑组织还能上调ER的表达使其更有利于与配体结合，放大其保护作用，且这些保护作用可部分或完全被ER拮抗剂他莫昔芬所抑制［21］。除中枢神经系统外，雌激素在外周神经系统也能发挥一定的保护作用。外周神经系统中的某些细胞可同时表达ER和神经营养因子受体，因此雌激素与神经营养因子可发挥“共调节”作用［22-23］，将雌激素作为另一种神经营养因子激活不同的信号转导通路，从而抑制细胞凋亡［24］。

本研究选择雄性大鼠更好地排除了性别造成的内源性雌激素的干扰，并且通过腹腔注射给药，有利于药物的充分吸收，且操作方便、重复性强。体内实验表明，雌激素在促进大鼠运功和感觉功能恢复的同时，还具有一定的抗炎作用。部分对照组大鼠在术后3 d出现自噬或者脚趾红肿等炎症反应，而17β-雌二醇组未出现该现象。可能是由于17β-雌二醇组术前1周的腹腔低剂量给药，使大鼠体内维持了一定浓度的17β-雌二醇，其通过血运到达损伤部位调节局部炎症反应，为损伤后的修复创造出一个相对温和的微环境。在术后第28天，17β-雌二醇组SFI明显优于对照组，但仍没有恢复到术前的水平。这是由于坐骨神经横断性损伤完全恢复周期为3个月，考虑到损伤后4～14 d是再生的黄金时期，并决定最终的修复效果，因此早期应用雌激素加速恢复能够为后期神经再生打下坚实的基础［25］。

本研究结果表明，17β-雌二醇能够促进雪旺细胞大量增殖并快速迁移，这些生物活性的改变有利于其更好地参与神经损伤后的修复。雪旺细胞分泌的胶质细胞源性神经营养因子对轴突的再生非常重要，能够促进轴突与靶器官的连接，从而加快损伤后运动和感觉功能的恢复。但17β-雌二醇具体通过何种途径调控雪旺细胞的生物活性以及抗炎与抗凋亡，具体机制还需要后期进一步研究。