刘宝翠，郑婷婷，董利阳，牟笑，许铖铖，毛朝明

（江苏大学附属医院核医学科，江苏镇江212001）

桥本甲状腺炎（Hashimoto′s thyroiditis，HT）是一种常见的器官特异性自身免疫性疾病［1］，是引发甲状腺功能减退最常见的病因，甲状腺滤泡组织结构的破坏和大量淋巴细胞的浸润是其主要病理基础［2-3］。小窝蛋白-1（Caveolin-1）是小窝的标志蛋白和主要蛋白成分［4］，与自身免疫性疾病的发生有一定相关性［5］。我们前期研究表明Caveolin-1在桥本甲状腺炎的甲状腺组织中呈现低表达［6］，提示Caveolin-1参与桥本甲状腺炎的发病。本研究通过慢病毒转染方式敲减甲状腺上皮细胞Nthy-ori 3-1中的Caveolin-1基因，旨在探索Caveolin-1表达降低对甲状腺上皮细胞增殖、凋亡及细胞内活性氧生成的影响，初步揭示Caveolin-1低表达对甲状腺上皮细胞损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人甲状腺上皮细胞株Nthy-ori 3-1（欧洲标准细胞收藏中心，ECACC）；人胚肾上皮细胞293T（中国科学院细胞库）；兔抗β-肌动蛋白抗体、兔抗Caveolin-1抗体（美国 Cell Signaling Technology公司）；HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（Santa Cruz公司）；RPMI 1640培养基、DMEM培养基、胎牛血清（Gibco公司）；牛血清白蛋白（上海生工生物工程技术服务有限公司）；总RNA提取试剂盒RNAiso Plus、逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司）；2×含染料Taq预混PCR反应试剂（北京康润诚业生物科技有限公司）；Caveolin-1 shRNA引物（苏州吉玛基因股份有限公司）；转染试剂LipoFiterTM（汉恒生物科技上海有限公司）；嘌呤霉素、聚凝胺（Sigma公司）；慢病毒包膜质粒pMD2.G、包装质粒psPAX2、shRNA慢病毒表达载体pLKO.1-嘌呤霉素（中国科学院上海生命科学研究院）；ECL发光液、全蛋白提取试剂盒、PVDF膜（美国Millipore公司）；MTT、活性氧检测试剂盒（南通碧云天生物公司）；AnnexinV Alexa Fluor 647/PI凋亡检测试剂盒（南京福麦斯生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 Nthy-ori 3-1细胞、293T细胞分别培养于含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的RPMI1640、DMEM培养基中，并于37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。

1.2.2 慢病毒包装及感染 质粒转染前1天将293T细胞接种至6孔板中，当细胞汇合度为60%时，将目的基因质粒sh Caveolin-1或空载pLKO.1与包膜质粒 pMD2.G、包装质粒 psPAX2用 LipoFiterTM转染试剂共转入293T细胞中（目的质粒或空载∶pMD2.G∶psPAX2=4∶1∶3）。收集48 h的病毒液，加入提前接种在6孔板中的Nthy-ori3-1细胞中，同时加入聚凝胺以提高病毒感染细胞的效率。6～8 h后弃病毒液换成完全培养基，48 h后用5 mg·L-1嘌呤霉素2～3 d筛选出所需细胞，获得sh-NC（空载质粒病毒感染）细胞和sh Caveolin-1（目的基因质粒病毒感染）细胞。空白对照组Nthy-ori 3-1细胞不做任何处理。

1.2.3 qRT-PCR检测Caveolin-1 mRNA表达 取各组处于对数生长期的Nthy-ori 3-1细胞，用Trizol法提取总RNA。在37℃1 h、85℃15 s、4℃保存反应条件下，将RNA反转录为cDNA。采用SYBRGreen法进行 qRT-PCR。Caveolin-1上游：5′-TCAACCGCGACCCTAAACACC-3′，下游：5′-TGAAATAGCTCAGAAGAGACA-3′；GAPDH上游：5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′，下游：5′-GGGTGGAATCATATTGGAACA-3′。反应条件为正常两步法，50℃2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，循环40次。以GAPDH作为内参，所得结果用2-ΔΔCt方法进行分析，实验独立重复3次。

1.2.4 蛋白质印迹检测Caveolin-1蛋白表达 收集用0.25%胰酶消化后的各组Nthy-ori 3-1细胞，加入细胞裂解液于冰上裂解细胞30 min，12 000×g离心3 min后，吸取蛋白上清液，加入5×上样缓冲液，混匀后100℃煮10 min后，每孔加5μg蛋白，10%SDS-PAGE分离胶进行蛋白电泳。60 mA恒流电泳至溴酚蓝刚好跑出，低温恒压转膜。用5%脱脂牛奶37℃封闭1 h，一抗（1∶1 000）4℃过夜，TBST洗膜（10 min×3次），用含HRP标记的山羊抗兔的二抗（1∶5 000）在37℃孵育1 h后，TBST洗膜（10 min×3次）后，ECL显影。实验独立重复3次。

1.2.5 MTT法检测Nthy-ori3-1细胞增殖 将各组Nthy-ori3-1细胞以3.5×103个/孔接种于96孔板中，每组设5个复孔，每孔加入200μL含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，置于37℃、5%CO2培养箱培养。24 h和48 h后，弃去上清液，每孔加入终浓度为0.5 g·L-1的MTT培养基100μL，孵育4 h。弃去上清液，每孔加入100μL DMSO振荡5～10 min，使结晶充分溶解。用酶联免疫分析仪（EXL800）测定490 nm波长各孔光密度（D）值。每组实验重复3次，计算细胞增殖率，细胞增殖率（%）=D实验组/D对照组×100%。

1.2.6 流式细胞术检测Nthy-ori3-1细胞凋亡 细胞培养24 h后，用无EDTA的胰酶消化并收集，250×g离心5 min。用100μL缓存液悬浮细胞，加入5μL AnnexinV/Alexa Fluor 647和10μL的PI溶液，混匀室温避光孵育15 min。孵育结束后，加400μL PBS混匀，流式细胞仪检测分析。

1.2.7 荧光探针DCFH-DA检测Nthy-ori 3-1细胞内活性氧水平 将各组细胞消化计数，以2×105个/孔加入6孔板中，培养过夜后，加入提前配制好的终浓度为10μmol·L-1的DCFH-DA探针，置于37℃、5%CO2的培养箱中避光孵育30 min。之后将细胞用胰酶进行消化，用不含胎牛血清的RPMI 1640重复洗涤3次。立即用流式细胞仪进行检测。

1.3 统计学分析

应用Graphpad Prism 6.0软件进行统计学分析，所有数据用均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Caveolin-1慢病毒载体转染Nthy-ori 3-1细胞的干扰效果验证

Caveolin-1慢病毒载体转染Nthy-ori 3-1细胞后，qRT-PCR和蛋白质印迹结果显示，与sh-NC组相比，sh Caveolin-1组细胞中 Caveolin-1的mRNA（t=21.70，P＜0.01）和蛋白水平（t=12.21，P＜0.01）明显下调；而sh-NC组与空白对照组间无明显差异。这一结果提示Caveolin-1敲减稳转细胞系构建成功。见图1。

图1 Caveolin-1慢病毒载体转染Nthy-ori3-1细胞的干扰效果验证

2.2 Caveolin-1敲减后Nthy-ori 3-1细胞增殖能力下降

MTT检测结果显示，与sh-NC组相比，sh Caveolin-1组 24 h（n=5；t=16.00，P＜0.01）和48 h（n=5；t=23.12，P＜0.01）的细胞增殖率均明显降低；而sh-NC组与空白对照组间无明显差异。见图2。sh Caveolin-1组24 h和48 h间细胞增殖能力无明显差异，故Caveolin-1敲减后最佳实验时间选为24 h。

图2 敲减Caveolin-1后Nthy-ori3-1细胞增殖率变化

2.3 Caveolin-1敲减后Nthy-ori3-1细胞凋亡增加

流式细胞术检测结果显示，与sh-NC组相比，sh Caveolin-1组细胞凋亡率明显增加（n=3；t=12.09，P＜0.01）；而sh-NC组与空白对照组间无明显差异。见图3。

2.4 Caveolin-1敲减后Nthy-ori 3-1细胞内活性氧水平升高

用活性氧检测探针DCFH-DA的平均荧光强度反映Nthy-ori 3-1细胞内活性氧的水平。流式细胞术检测结果显示，与sh-NC组相比，sh Caveolin-1组细胞内活性氧水平明显增加（n=3；t=16.835，P＜0.01）；而sh-NC组与空白对照组间无明显差异。见图4。

3 讨论

图3 敲减Caveolin-1后Nthy-ori3-1细胞凋亡率变化

图4 Caveolin-1敲减后Nthy-ori3-1细胞内活性氧水平变化

桥本甲状腺炎的发病率仅次于毒性弥漫性甲状腺肿（Graves病）［7］，且患病率在我国以每年5%的速度升高。迄今为止，桥本甲状腺炎的发病机制仍然不清楚，尚无针对病因的治疗措施。Caveolin-1是一种细胞表面穴样内陷中的主要膜蛋白，相对分子质量约为22 kDa，富含糖鞘脂和胆固醇［8］，参与癌症、糖尿病、心血管疾病、系统性硬化病、肺纤维化等多种疾病的发生［9-12］。Caveolin-1在桥本甲状腺炎的甲状腺组织中呈现低表达［6，13］，提示Caveolin-1参与桥本甲状腺炎的发病，然而其作用机制仍未完全清楚。

Caveolin-1定位于人染色体7q31.1，在上皮细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等一些终末细胞中含量丰富。Caveolin-1介导细胞内吞、胆固醇平衡、代谢转化，影响心肌细胞、肝细胞等的增殖和凋亡［14-15］。已有研究表明，在桥本甲状腺炎患者的甲状腺组织中，caspase-3、caspase-6等凋亡蛋白的水平明显高于正常甲状腺组织［16-17］。而Caveolin-1低表达是否与甲状腺上皮细胞凋亡有关，目前并不清楚。我们的研究结果显示Caveolin-1敲减后Nthyori3-1细胞的增殖能力显著降低，细胞凋亡率显著升高，提示Caveolin-1异常低表达可能通过诱导甲状腺上皮细胞的凋亡来参与桥本甲状腺炎的发病，表明Caveolin-1可能是桥本甲状腺炎治疗的一个潜在靶点。

活性氧是细胞内多种氧化还原反应的正常代谢产物，主要是一些短暂存在的具有高度活性且分子量较小的含氧代谢物［18］。生理浓度的活性氧可以作为第二信使参与细胞多种信号分子的调节，介导不同生物反应如参与基因表达、转录，细胞的生长、分化以及细胞死亡等一系列生理过程，在决定细胞命运中起到极其重要的作用［19］。然而，过多活性氧的生成是引发炎症反应的一种重要机制，甚至可以引发组织系统持续性炎症反应［19-20］。在正常生理状态下，甲状腺上皮细胞产生适量水平的活性氧参与甲状腺激素的合成［21］，但是高水平活性氧的产生则可诱发氧化应激从而导致甲状腺上皮细胞的损伤，引发甲状腺炎症促进桥本甲状腺炎的进展［19，22］。更为重要的是Kolypetri等［23］和本课题组［16］的研究发现活性氧可以诱导甲状腺上皮细胞凋亡。本实验结果显示，在Caveolin-1敲减后Nthyori3-1细胞中活性氧的表达升高，提示Caveolin-1低表达可能通过促进Nthy-ori 3-1细胞中活性氧的积累进而导致甲状腺上皮细胞凋亡的增加。

综上所述，体外Caveolin-1敲减后甲状腺上皮细胞增殖能力明显下降，凋亡和活性氧水平明显增加，提示甲状腺上皮细胞内Caveolin-1异常降低可能是桥本甲状腺炎发生、发展的重要原因，同时也提示Caveolin-1可能是桥本甲状腺炎干预的潜在靶点。