徐杰伟，陈美玲，廖黎黎，黄永汉

（佛山市第一人民医院生殖医学中心，广东佛山528000）

透明质酸是一种高分子量的黏多糖（糖胺聚糖），也是卵母细胞透明带基质的主要成分［1］。成熟的精子头部表面有透明质酸的受体，容易与卵细胞结合。精子-透明质酸结合率可反映精子的成熟度。精子-透明质酸结合试验试剂盒作为二类体外诊断试剂，目前正在做临床试验评价其检测性能，且国内尚无同类产品正式上市。佛山市第一人民医院生殖医学中心是精子-透明质酸结合试验试剂盒临床评价试验点之一。本研究通过分析精子-透明质酸结合试验结果与精液常规、精子DNA碎片率等指标间的相关性，探讨其评价精液质量的临床应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2018年4月至7月在佛山市第一人民医院生殖医学中心男科门诊就诊的男性患者549人，年龄19～52岁，平均31.6岁。患者选择标准：①成年男性，年龄18～60岁；②精液常规检查精子浓度≥20×106/mL，前向运动精子率（PR）≥10%；③标本的留取方式为手淫法或用特制的精液采集套采集。排除标准：①未禁欲_2～7 d的患者；②经精液常规检测判断为无精子症患者；③精液总量＜1.0 mL的标本；④因收集或保存不当不能用于检测的标本；⑤ 精子运动力过低者（PR＜10%）；⑥以性交方式留取标本的患者。所有研究对象均签署知情同意书，并得到我院伦理委员会同意。

1.2 精液标本采集及常规分析

所有研究对象均禁欲2～7 d，在生殖医学中心取精室内通过手淫法采集精液标本于无菌取精杯中，经电子天平称量精液体积，放置于37℃恒温板，待精液完全液化后，按《WHO人类精液检验与处理实验室手册（第五版）》标准［2］，用计算机辅助精液分析仪（美国HAMILTON THORNE IVOS，CASA）检测精子相关参数；用精密pH值试纸测定精液pH；用深圳华康生物医学工程有限公司提供的巴氏染色液进行精液涂片染色，在光学显微镜下进行精子形态学分析。

1.3 精子DNA完整性检测

采用精子染色质扩散试验（sperm chromatin dispersion test，SCD）检测精子DNA的完整性，试剂盒由深圳华康生物医学工程有限公司提供，检测过程严格按说明书操作。在普通显微镜高倍视野下，观察400个染色的精子，按判断标准计算精子DNA的完整率。精子DNA碎片率（%）=1-DNA完整率，表示精子DNA损伤程度。

1.4 精子-透明质酸结合试验

①在包被载玻片的“T”孔（测定孔）内加入液化的精液10μL，置于20～30℃的室温或恒温平台至少反应10 min，但不要超过20 min。②普通光学显微镜或相差显微镜40倍物镜下观察结果，计数“T”孔内500个活动精子，记录精子尾部持续鞭打但头部被结合在玻片表面难以自由前行的精子数量（成熟精子），不被结合的精子则呈现活动力不受限的自由运动状态。精子-透明质酸结合率（%）=（被结合精子数÷计数活动精子总数）×100%。试剂盒给定的正常参考值为≥58.5%［3］。

1.5 统计学分析

应用SPSS 18.0软件包进行实验数据处理，数据采用均数±标准差（x¯±s）表示，两组比较采用t检验；采用Pearson相关分析精子-透明质酸结合率与各项指标的相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精子-透明质酸结合试验检测结果

549例患者精子-透明质酸结合率测定范围为9%～89%，平均56.5%。其中275例结合率＜58.5%设为研究组，平均年龄（31.8±5.6）岁；274例结合率≥58.5%设为正常对照组，平均年龄（31.4±5.1）岁。

2.2 两组间精液常规参数、精子DNA碎片率比较

结果见表1。对照组的精子质量要优于研究组。两组间精液pH、精子浓度、前向运动百分比、头部缺陷率、残留胞质、活动率、正常形态率的比较有显著性差异（P＜0.05）；但精液体积、精子DNA碎片率间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 两组精液常规参数、精子DNA碎片率比较

2.3 精子-透明质酸结合率与其他指标的相关性

相关性分析结果显示，精子-透明质酸结合率与精子浓度（r=0.230，P=0.000），活动率（r=0.254，P=0.000），正常形态率（r=0.261，P=0.006），前向运动百分比（r=0.245，P=0.000）呈正相关；与头部缺陷率（r=-0.248，P=0.009），残留胞质（r=-0.219，P=0.022），精液 pH（r=-0.145，P=0.001）呈负相关；与精子DNA碎片率无明显相关性（r=0.010，P=0.864）。

3 讨论

精子-透明质酸结合试验作为一项新的评价精子成熟度的实验，已经逐渐在临床得到开展。成熟精子容易与卵细胞透明带结合，实现穿透与受精；不成熟的精子不具备与透明质酸结合的能力，预示着精子成熟障碍［3］。本研究测定了549例患者的精液标本，结果显示精子-透明质酸结合试验具有良好的测定区间，其测定范围是9%～89%。本组资料结果也显示精子浓度、活动率、正常形态率、头部缺陷率和残留胞质等指标对照组均优于研究组，而精液体积、精子DNA碎片率间的差异无统计学意义。相关性分析结果显示精子-透明质酸结合率与精子浓度、前向运动百分比、活动率、正常形态率等指标间呈正相关；与精液pH、头部缺陷率、残留胞质等指标间呈负相关；而与精子DNA碎片率无显著相关性。

Huang等［4］研究发现，精子-透明质酸结合试验选出的精子与胚胎学家根据传统形态学标准在显微镜下挑选出的精子的DNA完整性无显著的差异；Cohen-Bacrie等［5］测定1 600多例标本的研究结果显示，精子DNA损伤与快速前向运动、精子存活率无相关性；上述研究提示活动精子与DNA完整性间无显著性相关性，这与本研究的相关结果基本一致。

Nijs等［6］报道精子-透明质酸结合率与精子的形态、浓度和活力无关；刘瑜等［7］报道精子-透明质酸结合率与核蛋白组型转换异常率、精子DNA碎片率指标间存在较弱的负相关性，核蛋白组型转换率与精子DNA碎片率间呈正相关；亦有研究［8-9］认为成熟障碍的精子DNA碎片率高。这些研究均与本研究结果不一致，可能与精子-透明质酸结合试验检测的只是精液中的活动精子或研究对象入选标准不同有关。

Worrilow等的研究［10］表明，并非所有的活动精子都能结合透明质酸，与透明质酸结合的精子有着较为完整的DNA和染色体，精子质量好；相比于不能与透明质酸结合的精子，能与透明质酸结合的精子生育功能更强。Liu等［11-12］研究表明，受精失败多数是因为精子缺陷导致精子不能结合和穿透卵细胞透明带引起。

综上，精子-透明质酸结合试验敏感性好，能反映精子功能，精子-透明质酸结合率与精液质量具有良好的相关性，可以作为临床评价男性生育力的指标之一。