韩翠萍 葛子榜 刘庆冠 许 慧 江连洲 孙树坤*

（1 东北农业大学食品学院 哈尔滨150030 2 黑龙江省绿色食品科学研究院 哈尔滨150030）

豆腐是我国传统豆制品中历史最悠久的一种绿色健康食品，营养丰富，容易吸收，被人们誉为“植物肉”[1-2]。经常食用豆腐，可降低血清总胆固醇，降血压，降血糖，减少动脉硬化，同时对预防骨质疏松、癌症及保护心血管健康也能起到良好的作用[3-4]。豆腐种类繁多，我国豆腐主要分为南豆腐、北豆腐和充填豆腐。其中北豆腐主要是用盐卤作为凝固剂制成的蛋白凝胶产品，豆腐成品的水分含量相比南豆腐低，质地坚实，风味良好[5-7]。

豆腐营养丰富，为微生物提供了理想的生长繁殖环境，从而导致其保质期较短，影响豆制品的品质和销售期限，在一定程度上限制了豆制品行业的发展[8-9]。豆腐生产过程中的微生物污染更加难以控制[10]。虽然豆腐在加工过程中会受到各种细菌的污染，但最终只有部分微生物大量增殖，在腐败过程中占据主导地位[11]。

国内外对豆制品中腐败微生物进行了大量研究，结果表明豆腐的腐败与其物理性质和初始微生物密切相关[12-14]。Tuitemwong 等[15]研究了7 种品牌的传统豆腐在7 ℃贮藏1 d 和30 d 后的主要腐败菌，所分离的微生物中，最普遍的革兰氏阳性菌（G+）为链球菌属、片球菌属、乳杆菌；最普遍的革兰氏阴性菌（G-）为绿脓假单胞菌、恶臭假单胞菌、产气杆菌、阴沟肠杆菌。Franca 等[16]研究表明豆腐中的腐败菌主要来自原料的乳酸菌和在加工过程中出现的梭菌属和链球菌。在泰国市场和超市收集了59 个包装豆腐样品和74 个未包装的豆腐样品。主要鉴定的革兰氏阴性细菌是假单胞（56%）和大肠杆菌（28%），主要鉴定的革兰氏阳性菌是肠球菌属（77%）、乳酸菌（68%）、蜡状芽孢杆菌（41%）和葡萄球菌属（26%），无李斯特菌[21]。

本研究通过形态学特征，选择分离培养，采用比色法及VITEK2-Compact 高级全自动微生物鉴定系统等方法鉴定散装与盒装豆腐中腐败微生物，通过腐败菌回接试验，观察豆腐品质发生的变化，同时以总酸度为测定指标，确定不同腐败菌对豆腐品质的影响，可为北方豆腐生产中更好地控制微生物的污染提供一定的理论和技术支持，从而延长货架期，提高豆腐质量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

散装豆腐，市售；盒装豆腐，黑龙江北大荒农业股份有限公司。

革兰氏染液，北京奥博星生物技术有限公司；营养琼脂培养基，山东青岛海博生物技术有限公司；梅里埃GP 鉴定卡、梅里埃BCL 鉴定卡、酵母菌鉴定试剂盒（比色法）、API 0.85%NaCl（2 mL）培养基，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA323S-CW 分析天平，上海帅佳电子科技有限公司；GZX-9140MBE 电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；MLS-3780 高压蒸汽灭菌器，日本三洋电机株式会社；HF-1200B2 生物安全柜，上海力申科学仪器有限公司；生化培养箱，北京桑翌科技发展有限公司；真空包装机，广骏电器有限公司；VITEK2-Compact 高级全自动微生物鉴定及药敏分析系统，法国生物梅里埃股份有限公司。

1.3 腐败菌的分离纯化

将散装及盒装豆腐放置于室温下，至发生胀袋、发酸、发臭、发粘等腐败现象。在无菌条件下，随机取25 g 上述腐败豆腐制品于无菌均质袋中，溶解于225 mL 无菌生理盐水中，用拍击式均质器拍打1～2 min 后，取1 mL 上清液，用无菌生理盐水以10 倍稀释法稀释若干倍，并制成混合菌液。选取合适的稀释梯度，分别吸取200 μL 菌液加入NA 培养基平板，涂布均匀后于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h。

根据菌落形态特征不同，从合适的含菌平板上挑取形态特征不同的单个菌落，分别接种于TSB 培养基中，37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h。在无菌条件下，用无菌接种环沾取菌液分别划线接种于NA 培养基，37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h。重复上述步骤，直到得到纯菌株。

1.4 形态观察

观察细菌菌落形态，挑取单个菌落，用火焰固定，进行革兰氏染色，在显微镜下观察细菌形态[22]。

1.5 腐败菌的菌种鉴定

1.5.1 选择分离鉴定 将分离纯化后的纯培养物接种于孟加拉红选择培养基上，划线培养，于30℃的恒温培养箱中培养48 h 后观察。

1.5.2 富集培养 将分离纯化后的纯培养物接种于营养琼脂培养基上，划线培养，于37 ℃的恒温培养箱中培养18～24 h 后观察[23]。

1.5.3 细菌鉴定

1.5.3.1 浊度调整 取2～3 mL 无菌生理盐水于浊度管，挑取分离纯化后的单个典型菌落，于浊度管中，用移液枪反复吹吸，使菌液均匀，放置于载卡架上。注意浊度不能太大，否则影响鉴定结果。

1.5.3.2 接种鉴定卡 G+菌采用梅里埃GP 卡，芽孢杆菌采用梅里埃BCL 鉴定卡，将鉴定卡的上样管插入浊度管，放入填充仓中，启动填充程序，使菌液填充到鉴定卡的上样孔中，系统剪卡后，取出载卡架，培养10～18 h。

1.5.3.3 VITEK2 自动生化系统鉴定 开启鉴定系统，读取数据，VITEK2 自动生化系统会给出1～2 种可能菌株的名称，进行具体判断。

1.5.4 酵母菌鉴定 采用比色法，取出培养盒，倒入约5 mL 蒸馏水于盘的蜂窝小凹中，造成一个湿室。在盘的长边写上菌株编号，取出试条放入培养盒中。打开一个API 0.85%NaCl（2 mL）培养基安瓿。用接种环挑去一个或几个生长良好、形态相同的菌落，制成菌悬液，用比浊仪测量浊度，混匀酵母菌菌悬液。分别将制备好的酵母菌悬液加到小管部分，避免产生气泡，接种试条后，立即用矿物油覆盖前5 个试验和最后一个试验（即有下划线的试验），盖好培养盖，于（36±2）℃需氧环境下孵育18～24 h。观察颜色变化，鉴定菌种。

1.6 腐败菌回接及腐败现象分析

1.6.1 腐败菌回接

1） 原料预处理：将传统豆腐蒸汽加热10 min，以减少起始带菌量。

2） 腐败菌回接：分别吸取1 mL 含菌量为104CFU/mL 的几种腐败菌菌液，接种至装有20～25 g样品的真空塑封袋中，真空包装。接菌后的样品分别放置于37 ℃恒温培养箱中。连续观察样品腐败现象并测定总酸度变化。

1.6.2 总酸度测定 参照国标GB/T 12456-2008方法测定。

1.7 数据分析

采用SPASS17、Origin75 软件，通过单因素方差分析法对数据进行差异性比较（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 腐败菌的分离及形态学鉴定

从腐败散装与盒装豆腐中均分离出4 株典型的菌落，命名为菌种A、B、C、D，将接种菌落的营养琼脂平板置于37 ℃培养箱中培养18 h 后，观察平板上有典型的菌落生长。菌落形态及菌种生理生化特征如表1所示，菌种A、B、C、D 菌落形态图为图1～4 （分别为菌落正面图与菌落反面图），细菌形态图见图6，图5为菌株B 在孟加拉红培养基上的生长情况。试验结果表明，菌种A、C、D 均呈革兰氏阳性细菌，菌种B 呈革兰氏阳性酵母。

表1 菌落形态及菌种生理生化特征Table 1 Colony morphology and physiological and biochemical characteristics of bacteria

图1 菌种A 菌落形态图Fig.1 Colonial morphology of strain A

图2 菌种B 菌落形态图Fig.2 Colonial morphology of strain B

图3 菌种C 菌落形态图Fig.3 Colonial morphology of strain C

图4 菌种D 菌落形态图Fig.4 Colonial morphology of strain D

图5 菌种B 在孟加拉红培养基生长情况Fig.5 Growth of strain B in Bengal red medium

图6 4 种腐败菌细胞形态图Fig.6 Morphology of four spoilage bacteria

2.2 菌种鉴定

在2.1 节结果的基础上，菌种A、C、D 为革兰氏阳性细菌，采用VITEK2 自动生化系统方法结合GP 鉴定卡进行菌种鉴定，菌种B 为革兰氏阳性酵母，利用比色法结合酵母鉴定试剂盒进行菌种B 的鉴定。菌种A、C、D 鉴定结果如表2、3、4 所示。根据表2可知，菌种A 在A 号鉴定板培养12 h 后，系统给出的最大可能结果是溶血性葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus），其PROB 值为91%；根据表3知，菌种C 在C 号鉴定板培养18 h 后，系统给出的最大可能结果是短芽孢杆菌（Brevibacillus parabrevis），其PROB 值为90%；根据表5可以得出，菌种D 在D 号鉴定卡在培养12 h 后，系统给出的最大可能结果是托尔豪特链球菌 （Streptococcus thoraltensis），其PROB 值 为93%。根据表5可知，B 号酵母菌鉴定试剂盒在培养18 h 后，观察颜色变化，查阅鉴定表，鉴定结果为克假丝酵母（Candida krusei）。在本研究中鉴定的腐败细菌与以前的报道有些不同。Lee 等[20]在37 ℃培养24 h，从腐败的韩国豆腐中分离出的腐败菌为两株蜡状芽孢杆菌；Shin 等[21]在室温下贮存2 d 后从豆腐中分离的主要腐败菌是醋酸钙不动杆菌和肺炎克雷伯菌；No 等[22]从腐败的豆腐中分离出7 种细菌，鉴定为芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和阪崎肠杆菌。杨明[23]研究表明导致散装老豆腐腐败变质的主要腐败菌为梨形肠杆菌、发酵乳杆菌和肠膜明串珠菌；而导致盒装内酯豆腐腐败变质的主要腐败菌为类短芽孢杆菌。范文教等[24]研究表明豆腐中特定腐败菌为坚强芽孢杆菌。Dostson 等[25]认为豆腐中主要的腐败菌为乳酸菌。这些结果不同可能由于原材料在不同生产环境中，受不同微生物所污染导致。

表2 菌种A 培养12 h 后鉴定结果Table 2 The identification results of strain A after cultured for 12 h

表3 菌种C 培养18 h 后鉴定结果Table 3 The identification results of strain C after cultured for 18 h

表4 菌种D 培养12 h 后鉴定结果Table 4 The identification results of strain D after cultured for 12 h

表5 菌种B 在（36±2）℃培养18 h 后阳性反应率Table 5 The positive reaction rate of strain B after cultured for 18 h at （36±2）℃

2.3 腐败菌回接现象及腐败现象分析

2.3.1 腐败菌回接现象 将上述4 种腐败细菌回接到两种豆腐制品中，观察腐败现象。根据表6试验结果表明，克假丝酵母、溶血性葡萄球菌及托尔豪特链球菌是导致豆腐发粘、涨袋及质构变软的主要微生物，而短芽孢杆菌对豆腐品质变化无明显影响。

2.3.2 总酸度测定 在2.3.1 节试验结果的基础上，以总酸度为测定指标。图7、图8分别为在37 ℃保存条件下散装、盒装豆腐的总酸度变化，其中总酸含量（以乳酸计，g/100 g 样品）[23]，空白组为无腐败菌回接组，散装豆腐空白组总酸度为0.03897 g/100 g，盒装豆腐空白组总酸度为0.0996 g/100 g。根据图7、图8结果显示，接种克假丝酵母、溶血性葡萄球菌及短芽孢杆菌的豆腐变酸程度显著小于空白组及接种托尔豪特链球菌的处理组，而接种托尔豪特链球菌的豆腐总酸含量大于或接近空白组，得出托尔豪特链球菌是导致两种豆腐变酸的主要菌种。故对豆腐品质变化有影响的腐败菌主要是克假丝酵母、溶血性葡萄球菌及托尔豪特链球菌。

表6 腐败细菌回接试验腐败现象（37 ℃）Table 6 The spoilage phenomenon of bacteria-inoculated Tofu （37 ℃）

图7 腐败细菌回接试验的总酸度变化（散装豆腐，37 ℃）Fig.7 Changes of total acid of bacteria-inoculated Tofu（no-packing tofu，37 ℃）

图8 腐败细菌回接试验的总酸度的变化（盒装豆腐，37 ℃）Fig.8 Changes of total acid of bacteria-inoculated Tofu（boxed tofu，37 ℃）

3 结论

通过对分离、纯化后的菌株进行形态观察，选择分离培养，再通过比色法以及VITEK2-Compact高级全自动微生物鉴定系统鉴定散装与盒装豆腐中的主要腐败微生物，最后得出分离菌株分别为溶血性葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、克假丝酵母（Candida krusei）、短芽孢杆菌（Brevisbacillus choshinensis）、托尔豪特链球菌（Streptococcus thoraltensis），其中克假丝酵母、溶血性葡萄球菌及托尔豪特链球菌是导致豆腐发粘、涨袋及质构变软的主要微生物，而短芽孢杆菌对豆腐腐败变质无明显影响。接种克假丝酵母、溶血性葡萄球菌及短芽孢杆菌的豆腐变酸程度显著小于空白组及接种托尔豪特链球菌的处理组，而接种托尔豪特链球菌的豆腐总酸含量大于或接近空白组，托尔豪特链球菌是导致两种豆腐变酸的主要菌种。对豆腐品质变化有影响的腐败菌主要是克假丝酵母、溶血性葡萄球菌及托尔豪特链球菌。