杜利君，张 兵，李 欣，杨 波，邢 晏

(1.南充市中心医院/川北医学院第二临床学院检验科，四川南充 637000；2.西华师范大学数学与信息学院,四川南充 637000)

结核病是一种由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的传染病，严重危害着人类的生命健康。根据世界卫生组织(WHO)2017年全球结核病报告显示，2016年全球结核病发病的人数为1 040万,中国是全球30个结核病高负担国家之一[1]。此外，在我国甲、乙类传染病病死率中，肺结核排名第2位，其实验室诊断率不足40%[2]。由于结核病的诊断较为复杂，既往的细菌病原体检测、结核菌素皮肤试验(TST)、抗结核抗体检测及影像学检查等诊断方法远远不能满足临床需求[3]。经过不断地研究，以T淋巴细胞免疫为基础的体外γ-干扰素释放试验(IGRAs) 近年来在临床得到广泛应用。IGRAs检测的基本原理是MTB特异性抗原-早期分泌抗原6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)在体外刺激全血中的T淋巴细胞产生γ干扰素(IFN-γ)，通过酶联免疫吸附测定实验法(ELISA)测定 IFN-γ水平来判断受检者是否感染MTB。虽然IGRAs已成为国内外结核诊疗指南推荐的重要实验室检测方法[4-5]，是临床诊断结核病的重要辅助手段，但在检测过程中，除了有阴性结果、阳性结果外，还会产生一定比例的不确定结果(ITRs)[6]。不确定结果不能反映患者的结核感染状况，可能引起临床医生诊断MTB感染的混乱及正确解释IGRAs不确定结果的困难；此外，在检测过程中一旦遇到不确定结果，实验室将重新采集标本复查，延误报告时间及增加检测成本。因此，本文通过回顾2014年7月至2018年7月在本院检测的可疑结核感染患者或需排除结核感染患者的IGRAs，分析不确定结果发生的比率及原因，为临床了解IGRAs不确定结果可能发生的疾病因素及正确解释IGRAs不确定结果报告提供依据和思路，同时为优化试剂盒性能、提高IGRAs检测的可靠性和准确性奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾2014年7月至2018年7月在本院1 781例可疑结核感染患者或需排除结核感染患者的IGRAs检测结果，年龄为(48.23±19.84)岁，其中男1 139例，女642例。按不同年龄分为3组，<18岁组163例，18～65岁组1 100例，≥65岁组518例。

1.2 仪器与试剂 IGRAs试剂盒(北京万泰生物药业股份有限公司)，恒温培养箱(上海博迅公司)，Mutiskan FC酶联免疫检测仪(赛默飞世尔仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 IGRAs试验 严格按照试剂盒说明书操作。采集4 mL肝素锂抗凝静脉全血，2 h之内送至实验室。按每管1 mL全血分装至本底对照培养管(N管)、测试培养管(T管) 、阳性对照培养管(P管)，轻柔颠倒混匀5次后，将培养管直立于37 ℃恒温箱中，温育22～24 h。将培养后的培养管以3 000 r/min，离心10 min，通过ELISA检测上清液中的γ-干扰素(IFN-γ)水平，酶标仪在波长450 nm处测定其吸光度A，根据试剂盒中校准品制作标准曲线，计算IFN-γ水平。

1.3.2 实验室质量控制 由6个标准液的吸光度A值与相应浓度计算得出的相关系数(r)≥0.99； 400 pg/mL的标准液的平均吸光度A值<1.0。

1.3.3 判断标准 所得不确定结果均需重新采集样本复查，以排除实验因素引起不确定结果，复查后仍为不确定，则判定为不确定结果，见表1。

表1 IGRAs检测结果的判定标准(pg/mL)

注：n=本底对照培养管(N管)、T=测试培养管(T管)、P=阳性对照培养管(P管)

1.4 统计学处理 回顾2014年7月至2018年7月例患者的IGRAs检测结果，用Excel 2007软件建立数据库，用SPSS22.0软件进行统计分析。计数资料用百分率表示，组间比较用χ2检验，采用二元Logistic回归进行单因素与不确定结果的分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 IGRAs的检测结果 1 781例IGRAs检测样本，阳性569例(31.95%)，阴性1 151例(64.63%)，不确定结果61例(3.43%)。

2.2 不同性别患者IGRAs的检测结果比较 1 781例IGRAs检测样本中，男性1 139例，女性642例，男性阳性率为33.45%，女性阳性率为29.28%，差异无统计学意义(χ2=3.208，P=0.075)；男、女患者ITRs分别为3.34%，3.58%，差异无统计学意义(χ2=0.073，P=0.784)，见表2。

表2 不同性别患者IGRAs的检测结果比较[n(%)]

2.3 不同年龄组的IGRAs的检测结果比较 1 781例IGRAs检测样本中，<18岁组的患者IGRAs阳性率明显低于18～65岁组和≥65岁组，差异有统计学意义(χ2=28.448,P=0.000)；与18～65岁组比较，<18岁组和≥65岁组ITRs发生率较高，差异均有统计学意义(χ2值分别为10.584、9.015；P=0.001、0.003)。<18岁组和≥65岁组ITRs发生率比较，差异无统计学意义(χ2=0.722，P=0.396)，见表3。

表3 不同年龄组的IGRAs的检测结果比较[n(%)]

2.4 检测IGRAs的确诊疾病类型与ITRs的关系 对61例可疑结核感染患者IGRAs的ITRs标本进行回访，剔除4例资料不全患者，经二元logistic回归分析，自身免疫性疾病(OR为2.84;95%CI为1.50～5.39;P=0.001)、HIV感染患者(OR为3.04;95%CI为 1.26～7.35;P=0.013)的ITRs与确定结果(阴性/阳性)差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 检测IGRAs的确诊疾病类型与ITRs的关系

注：与阴性/阳性确定结果比较，*P<0.05

3 讨 论

目前，大量研究评估了IGRAs在疑似结核病患者诊断中的临床应用价值[7-8]，而较少研究IGRAs检测中出现的不确定结果。DIEL等[9]研究显示，IGRAs的不确定结果发生率在3%～21%，不确定的结果可能限制IGRAs使用的有效性，影响结核病的诊断和治疗。因此，除了关注IGRAs检测的阴性或阳性结果之外，还应重视IGRAs不确定结果发生的比例和原因，为临床疾病的诊断和治疗提供帮助。

本研究显示临床怀疑或者需排除结核感染的患者检测IGRAs的不确定结果发生率为3.43%，与TEBRUEGGE等[10]研究基本一致，不确定结果主要在患有慢性疾病如风湿性疾病[11]或免疫功能低下[12]的患者中出现，而产生不确定结果的潜在性因素可能主要是由于阳性对照管弱应答植物血凝素(PHA)的刺激，产生低水平的IFN-γ；或者少量患者出现无PHA刺激的本底对照管的高水平IFN-γ背景[13-14]。本研究显示，不确定结果在<18岁组与≥65岁组发生率较高，而在18～65岁组较低，提示免疫功能是否完善在IGRAs的不确定结果发生中具有重要作用，儿童青少年免疫功能尚处在发育阶段，老年人免疫功能逐渐衰老，年龄可能是PHA诱导IFN-γ应答高低的关键因素，使用年龄特异性的阳性对照截断值，或掺入另一种产生相似的阳性对照刺激物，可能提高IGRAs试剂盒在儿童青少年和老年人群中的检测性能，降低不确定结果的发生率[10]。此外，本文未发现性别与IGRAs的不确定结果发生率的差异，在关于性别与不确定结果的关系研究中，研究的结论并不一致，BEFFA等[15]通过对1 429例患者如有结核接触史、或TST(+)、或结核病、或可疑结核患者进行分析，认为性别与不确定结果的发生无关；而JUNG等[16]通过对631例风湿疾病患者的研究，发现女性与IGRAs不确定结果发生更为密切，性别与不确定结果关系研究结论不一致可能与纳入研究对象的疾病类型、样本数量、种族、地理来源、卡介苗接种史和伴随免疫抑制剂的标准治疗使用有着密切的关系[17]。

免疫功能低下或机体长期处于慢性炎症的作用下，可能增加活动性结核病的发病风险[18]，患者的IGRAs不确定结果与免疫功能低下和慢性炎症密切相关[19-20]。因此，进一步回顾分析了1 781例患者的疾病种类，以判断不确定结果发生的危险因素，结果显示自身免疫性疾病、HIV感染患者的不确定结果与确定结果(阴性/阳性)差异有统计学意义(P<0.05)，提示不确定结果的发生可能与自身免疫性疾病、HIV感染患者关系密切。在自身免疫性疾病的发病机制中，发挥关键作用的TH17炎症通路下调了由Th1途径产生的IFN-γ水平，此外，在治疗过程中使用免疫抑制剂、导致免疫功能低下、使全血中的T淋巴细胞体外低应答PHA的刺激，阳性对照管产生较低水平的IFN-γ[20]。 HIV感染患者不确定结果的发生可能与HIV病毒感染攻击CD4+T细胞，使T细胞功能丧失，导致低应答PHA刺激有关，值得注意的是，在中晚期免疫缺陷患者中，不确定的IGRAs结果将增加严重临床事件发生的风险。此外，研究者未发现不确定结果与慢性炎症组的关系，可能与本次研究纳入的样本量较小有关。

本研究属于回顾性研究，存在一定的局限性。未评估不确定结果与临床免疫抑制剂的使用情况，与反映免疫功能的实验室指标的关系，如淋巴细胞数量、清蛋白水平、CD4+细胞计数等，以及未评估其他可能影响不确定结果的检测因素，如标本采集及处理时间、标本送检的季节和温度，及技术错误等。

综上所述，通过回顾分析本院检测的可疑结核感染患者或需排除结核感染患者IGRAs的不确定结果发生的比率及原因，发现不确定结果发生不仅与年龄因素关系密切，还与患者的免疫功能状态或免疫抑制剂的使用密切相关。