黄丽琼，郑 波△，张元珍

(1.咸宁市中心医院湖北科技学院附属第一医院妇产科，湖北咸宁 437000； 2.武汉大学中南医院妇产科，湖北武汉 430071)

子痫前期(子痫前期)是妊娠期特有的多器官多系统疾病，母儿并发症多，病死率高，其发病机制至今仍未明确，目前采用的治疗方式仍然是终止妊娠。2-甲氧雌二醇(2-ME)是17β雌二醇经细胞色素P450(CYP450)羟基化然后由COMT甲基化生成的代谢产物。2008年KANASAKI等[1]首次发现子痫前期患者体内2-ME水平降低，敲除COMT基因的小鼠可出现子痫前期症状，并能通过补充2-ME得以改善。虽然此后，不断有学者进行2-ME/COMT与子痫前期关系的研究[2-4],但有关早发型子痫前期的研究罕见，而且COMT与子痫前期关系结论也不一致[5-6]。本课题组在前期实验中发现晚发型子痫前期患者血清2-ME水平升高，胎盘COMT蛋白表达无明显变化[7]。这一结论在早发型子痫前期患者中是否一致？为此设计此项研究来探讨2-M/COMT与早发型重度子痫前期的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 子痫前期的划分标准按照中华医学会颁发的《妊娠期高血压疾病诊治指南(2012版)》执行，收集25例2014年3月至2017年3月期间咸宁市中心医院妇产科收治的早发型重度子痫前期病例(孕周为28～34周，EOSPE组)，随机选取同期健康对照组(NP组)25例，标准为孕周小于34周早产的单胎健康孕妇。收集包括孕妇年龄、孕产次、分娩孕周、体质量指数(BMI)、期待治疗时间、收缩压和舒张压的临床基本资料。研究已得到入组的健康孕妇与子痫患者的同意并签署知情同意书，且课题研究通过咸宁市中心医院医学伦理委员会批准。

1.2 血清2-ME水平检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清2-ME水平。乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集两组患者外周肘静脉血10 mL，室温直立静置半小时后，以1 000 r/min离心15 min吸取上层血清样本，-80 ℃超低温保存待用。根据2-ME ELISA试剂盒(润裕生物，上海)说明书同批次检测血清2-ME水平，保证批差异小于5%。

1.3 胎盘COMT表达 分娩后10 min内，无菌状态下以无菌剪刀剪取2块约1 cm×1 cm×1 cm大小的胎盘绒毛膜组织，取材时注意避开胎盘中央母体面的出血、坏死或钙化的区域。并立即用PBS磷酸缓冲液(PH 7.2)漂洗组织标本2次。其中一块组织样本以石蜡包埋处理，以用于后期免疫组化(IHC)检测COMT表达；另一块直接液氮冷冻保存，用于提取mRNA与蛋白样本。注意给标本进行编号区分。

1.3.1 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测胎盘中COMT mRNA 按Trizol说明书提取总RNA，反转录合成cDNA，再使用实时荧光定量PCR仪(ABI7300型),引物见表1，进行PCR扩增，采用2-△△Ct法对结果进行分析。以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参。

1.3.2 胎盘COMT蛋白检测方法

1.3.2.1 免疫组化检测 胎盘组织块脱蜡后，滴加1%双氧水(H2O2)5%牛血清白蛋白封闭液，室温10 min。抗原修复后封闭30 min，加一抗4 ℃过夜，加二抗孵育30 min，DAB染色液显色苏木精复染，蒸馏水冲洗切片后，按病理标本处理标准进行乙醇梯度脱水后，以二甲苯透明切片，并用中性树脂进行永久封片后，置于光学显微镜下观察胎盘组织COMT蛋白免疫染色，定义将细胞质与/或细胞核染成棕黄色颗粒物为阳性染色。

1.3.2.2 采用蛋白质印迹法(Western Blot)法 取适量的胎盘组织块，蛋白提取液，待组织充分裂解后，采用BCA试剂盒进行蛋白定量。每泳道上样50 μg，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白电泳后以PVDF膜进行转膜45～60 min，转膜结束后5%脱脂奶粉封闭膜1 h，将相应COMT一抗按1∶1 000稀释后，4 ℃孵育PVDF膜过夜，PBS缓冲液冲洗膜后，带辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释1∶2 000)孵育1～2 h，PBS缓冲液冲洗膜后，在膜上滴加几滴ECL化学发光底物，放入凝胶成像系统进行曝光显影，采用相应内参灰度值作为对照，对蛋白条带进行相对定量分析。

表1 RT-PCR引物及序列

2 结 果

2.1 研究对象的临床资料 两组患者年龄、孕产次、孕周、孕前BMI比较差异均无统计学意义(P>0.05)，提示研究背景一致性；采血日BMI、收缩压、舒张压两两比较，差异有统计学意义(P<0.05)。分娩孕周、期待治疗时间在EOSPE组和NP组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.2 两组血清2-ME水平比较 EOSPE组孕妇血清2-ME水平为(525.3±172.6)pg/mL，NP组孕妇血清2-ME水平为(705.9±157.4)pg/mL，差异有统计学意义(P<0.05),见表2，提示早发型重度子痫前期孕妇血清中2-ME水平比健康孕妇降低。

表2 两组孕妇临床资料比较

注：与NP组比较，*P<0.05

2.3 两组胎盘COMT的表达比较

2.3.1 RT-PCR法检测胎盘COMT mRNA的表达水平 EOSPE组孕妇胎盘组织中COMT mRNA相对表达量为(0.447±0.152)，NP组孕妇胎盘组织中COMT mRNA相对表达量为(0.467±0.151)，差异无统计学意义(P=0.678)。

2.3.2 免疫组化检测胎盘COMT蛋白表达 两组孕妇胎盘组织中均有COMT表达，COMT表达定位在合体滋养细胞，见图1箭头所指，表达结果均为阳性。

注：A为NP组，B为EOSPE组

图1 免疫组化检测两组胎盘COMT的表达情况(×200)

2.3.3 Western Blot检测胎盘COMT的表达 COMT有两种蛋白亚型，根据蛋白定位分为胞浆型(S-COMT)和膜结合型(MB-COMT)，胎盘COMT活性以S-COMT为主。EOSPE组孕妇胎盘组织中COMT蛋白相对表达量(0.891 6±0.102 0)，NP组孕妇胎盘组织中COMT蛋白相对表达量(0.924 0±0.158 7)，差异无统计学意义(P=0.422)，见图2。

图2 两组孕妇胎盘组织中COMT蛋白相对表达量

2.4 EOSPE组血清2-ME与临床资料的相关性分析 EOSPE组血清2-ME与临床指标进行相关性分析并做出散点图，其中EOSPE组2-ME水平与收缩压是呈负相关(r=-0.648，P<0.05)；与期待治疗时间呈正相关(r=0.694，P<0.05)。见表3、图3、4。

图3 血清2-ME与收缩压相关性散点图

图4 血清2-ME与期待治疗时间相关性散点图

3 讨 论

子痫前期是严重危害母婴健康的妊娠期并发症。世界卫生组织(WHO)年报显示，全世界每年大约有1 500万例早产儿，其中约有20%与子痫前期有关[8-9]。在经济欠发达国家，子痫前期发病率和因子痫前期导致的孕妇病死率和新生儿早产率是经济发达国家的20倍以上[10]。早发型子痫前期的发病早，母体病情发展迅速，疾病的进展期也不容易预判，且并发症重，目前临床的最佳治疗方法就是适时终止妊娠。因此能够预测病情发展，恰当的延长孕周，选择最佳的终止妊娠时机，对改善孕妇和胎儿的不良结局有着关键作用。

2-ME是17β雌二醇在体内经COMT甲基化的生物活性代谢产物。曾有国外学者研究发现，重度子痫前期孕妇血清2-ME水平(982 pg/mL，3 nmol/L)，与轻度子痫前期(1 813 pg/mL，6 nmol/L)和正常足月孕妇(2 186 pg/mL，7 nmol/L)比较明显降低，这与本研究结论基本一致[11]。此外，还有研究发现：在孕11～14周，血清2-ME水平低的孕妇(1.9×2 pg/mL，0.006 nmol/L)比健康孕妇(61.7×27 pg/mL，0.204 nmol/L)更容易发展为子痫前期[5]。上述数据表明，妊娠早期血清2-ME水平低可能与妊娠后期发展为子痫前期有关。LEE等研究者[12]发现在2.5%的低氧环境下，2-ME能诱导胎盘滋养细胞分化成侵袭表型，从而更有效地促使细胞浸润生长。滋养层细胞成功入侵，其中低氧环境是重要因素之一，但并非是唯一的因素。2-ME可以通过保护母体血管功能、诱导滋养细胞侵袭表型分化、维持胎盘滋养细胞正常浸润生长，从而达到预防子痫前期发生。本研究发现，EOSPE组患者血清2-ME水平和收缩压呈负相关(r=-0.648，P<0.05)，但NP组中血清2-ME水平和收缩压未发现具有相关性。虽然EOSPE组患者血清2-ME水平低，与病情程度具有一定的相关性，而且有证据证明2-ME可以抑制心血管平滑肌收缩、生长，防止血管动脉粥样硬化并维持心血管功能有相当大的作用[13]，还有实验发现2-ME能防止鼠大动脉平滑肌收缩[14]。以上证据均显示2-ME通过对心血管平滑肌抑制、对内皮细胞功能影响，帮助孕妇维持心血管功能和血压稳定。

在保证子痫前期孕妇和围产儿安全的前提下，对无严重并发症的早发型重度子痫前期缓和采取保守治疗(又称期待疗法)，可适当延长孕周，减少因胎儿不成熟而致围产儿死亡，降低患者严重并发症发生概率。保守治疗需要对患者和胎儿的严密监护，虽然延长了孕周，但由于此类病情发展迅猛，严重的并发症不但会导致孕产妇器官功能损害，反而增加了围产儿患病率、病死率。本课题组研究孕妇血清2-ME水平与保守治疗(期待疗法)时间呈正相关(r=0.694，P<0.05)，提示低2-ME水平的早发型子痫前期患者延长孕周时间有限，需根据病情变化，适时终止妊娠。

COMT是雌二醇、儿茶酚胺降解的关键酶，广泛存在于人体各个器官，在孕妇胎盘、肝脏、脑组织中含量高。COMT根据蛋白定位分为胞浆型(S-COMT)和膜结合型(MB-COMT)两种蛋白亚型，孕妇胎盘COMT以胞浆型为主。2008年KANASAKI 等[1]通过实验敲除小鼠COMT基因，成功制造子痫前期小鼠模型。这些COMT基因敲除小鼠给予2-ME灌胃，子痫前期症状得到较大改善。LEE等[12]发现在3例重度子痫前期患者胎盘中发现COMT表达降低，与KANASAKI[1]结论一致。2017年的一项动物实验研究发现COMT缺乏可诱发高血压，机制可能与其促进机体对血管紧张素Ⅱ敏感性有关；而2-ME可通过弥补COMT缺乏来改善血压紊乱[15]。这些研究结果似乎证明了胎盘中COMT的活性与子痫前期发病关系密切，但这些研究从统计学意义上来说，病例数非常有限。本实验中亦未发现COMT在2组孕妇体内存在差异。因此提示2-ME在子痫前期孕妇体内水平降低原因可能不一定是COMT酶水平降低和/或活性减少；亦有可能其他代谢途径的异常导致，比如S-腺苷蛋氨酸的生物利用度降低或17β-雌二醇生物利用度下降等[16]。由以推测相对于COMT，2-ME可能对促进母体妊娠期胎盘正常发育及保护血管内皮功能有更积极的作用。

4 结 论

血清2-ME水平降低可能会导致子痫前期发生，通过检测子痫前期患者血清2-ME水平与健康孕妇血清2-ME水平，及时掌握病情严重程度，可能对指导延长孕周，适时终止妊娠，达到降低子痫前期母儿相关并发症的发生率、改善孕妇和胎儿的不良结局有一定作用。