合肥地区耐多药结核分枝杆菌异烟肼、链霉素及乙胺丁醇耐药相关基因位点表达研究

2019-08-02戚应杰查晓丹石玉如马筱玲

国际检验医学杂志 2019年14期

戚应杰,刘婷,查晓丹,石玉如,王云,岳莉,马筱玲

(中国科学技术大学附属第一医院/安徽省立医院感染病院区检验科,安徽合肥 230000)

近年来，全球结核病的防控面临严峻的考验，尤其是耐多药结核病(MDR-TB)的流行，MDR-TB定义为至少对利福平(RFP)和异烟肼(INH)耐药。据2018年世界卫生组织(WHO)全球结核病报告估计[1]，目前全球MDR-TB 患者约有30 万人,且MDR-TB的治愈率仅有55%，2017年约有18万人死于MDR-TB。MDR-TB 的防控迫在眉睫。INH、链霉素(SM)、乙胺丁醇(EMB)是现阶段治疗结核病最为常用的一线药物[2]。本文采用基因芯片法与测序法对101株耐多药结核分枝杆菌三种常用一线药物INH、SM、EMB的耐药基因位点表达情况进行更进一步探究，为应用适合合肥地区甚至更大范围快速检测MDR-TB INH、SM、EMB的耐药性提供更多的分子诊断数据。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 101株耐多药结核分枝杆菌均取自2013年1月至2017年12月在本院接受诊治的结核病患者。结核分枝杆菌标准野生对照株为H37Rv(ATCC27294)由中国疾病预防控制中心传染病控制所提供。

1.2 仪器与试剂美国ABI公司ABI7300基因扩增仪；深圳亚能公司YN-H16分子杂交仪；操作按仪器说明书进行。结核耐药突变检测试剂盒购自深圳亚能生物技术有限公司； INH、 RFP、EMB、 SM药敏培养基和菌种鉴别培养基购自珠海贝索生物技术公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离鉴定和体外药物敏感试验分离到的阳性分枝杆菌菌株，采用WHO推荐的改良罗氏培养基比例法，培养2～3周，用含对硝基苯甲酸(PNBA) 和噻吩-2-羧酸肼(TCH) 的鉴别培养基进行菌种鉴定。各含药培养基内的药物临界浓度分别为INH 0.2 mg/L，RFP 40 mg/L，SM 4 mg/L，EMB 2 mg/L。菌株在做药物敏感性试验的同时采用PNB/TCH进行菌群的初步鉴定，鉴别结核、非结核和牛分枝杆菌，见表1。

1.3.2 细菌基因组DNA提取从改良L-J培养基斜面生长良好的耐多药结核分枝杆菌刮取一菌环，溶于200 μL缓冲液(pH=8.0)中，经85 ℃水浴30 min灭活，取菌悬液20 μL加入20 μL M裂解液混匀，然后95 ℃沸水煮沸10 min，相对离心力(RCF)=6 285×g离心2 min，取上清液转移至新管中即为DNA模版，-20 ℃保存。

表1 结核、非结核和牛分枝杆菌鉴定

1.3.3 耐多药结核分枝杆菌基因聚合酶链反应(PCR)扩增取4 μL DNA模版加入扩增管内，RCF=3 142 g离心2 s后放入PCR仪按程序扩增，扩增条件为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 45 s、54 ℃ 30 s、68 ℃ 60 s×40次，68 ℃延伸5 min。从http://ww.ncbi.nlm.nih.gov的Genbank中获得结核分枝杆菌标准株H37Rv的katG、inhA、embB、rpsL、rrs基因序列[3]。采用primer premier 5.0设计引物，引物序列见表2。

表2 基因合成引物序列

1.3.4 基因芯片杂交、洗膜显色与结果判断将PCR产物25 μL加入离心管中沸水煮10 min，放入已经预热的杂交箱中于58.3 ℃杂交2 h，取出膜条洗涤15 min，最后将膜条浸泡在显色液中避光显色观察结果，蓝色为检出该位点。该基因芯片法可检测异烟肼耐药相关突变位点：315M、-15M；链霉素耐药相关突变位点：43M、88M；乙胺丁醇耐药相关突变位点：306M1、306M2、306M3。

1.3.5 DNA序列分析 101株耐多药菌株和部分正常样本送往深圳亚能生物公司进行序列分析，以便于检测DNA扩增的特异性和基因芯片杂交结果的准确性，同时便于挖掘新的耐药基因突变位点。测序结果比对用GENUe软件中的Align将测序结果与标准菌株H37Rv的基因序列进行比对[4]，确定基因突变位点。

1.4 统计学处理采用数理统计软件SPSS19.0对收集的数据进行整理与统计分析，率及构成比等计数资料的比较行χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 101株MDR-TB的SM、EMB耐药率 101例MDR-TB中对SM耐药的70例，耐药率69.3%；对EMB耐药的52例，耐药率51.4%；对SM和EMB二者均耐药的45例，耐药率44.5%。

2.2 基因芯片法检测INH、SM及EMB基因突变位点分布情况 101例MDR-TB中基因芯片法检出95例INH耐药相关基因，其中74例katG基因315M位点突变，突变率为77.8%；85例inhA基因-15M位点突变，突变率为89.4%；72例315M与-15M位点共同突变，突变率为75.7%。检出64例rpsL SM耐药相关基因，其中57例43M位点突变，突变率为89.0%；7例88M位点突变，突变率为11.0%。检出47例embB EMB耐药相关基因，其中16例306M1位点突变，突变率为34.0%；32例306M2位点突变，突变率为68.0%；2例306M3位点突变，突变率为4.2%。

2.3 测序法检测INH、SM及EMB基因突变位点分布情况 101例MDR-TB中测序法检出98例INH耐药相关基因突变，其中72例katG基因315位点突变，突变率为73.4%，2例katG基因463位点突变，突变率为2.0%；86例inhA基因-15位点突变，突变率为87.7%，1例inhA基因-8位点突变，突变率为1.1%，1例inhA基因-17位点突变，突变率为1.1%；10例oxyR-ahpC基因-12位点突变，突变率为10.2%,8例oxyR-ahpC基因-10位点突变，突变率为8.2%。检出68例SM耐药相关基因突变，其中59例rpsL基因43位点突变，突变率为86.8%；9例rpsL基因88位点突变，突变率为13.2%；4例rrs基因512位点突变，突变率为5.9%，6例rrs基因513位点突变，突变率为8.8%，6例rrs基因516位点突变，突变率为8.8%。检出50例embB EMB耐药相关基因，其中44例306位点突变，突变率为88.0%；2例406位点突变，突变率为4.0%。

3 讨论

随着抗菌药物大量应用使得结核病也出现了新的分型，MDR-TB便是其中之一。MDR-TB的出现不仅增加了结核病治疗的难度，而且为患者的生命安全带来了极大的威胁，MDR-TB控制的关键是早期选择敏感药物联合治疗[5]。INH、SM和EMB是抗结核治疗的主要一线药物，如何早期快速检测其在MDR-TB中的耐药性对MDR-TB的及时有效治疗至关重要。目前的研究表明，结核分枝杆菌耐药的主要机制是因为基因突变，结核分枝杆菌katG、inhA、embB、rpsL基因的点突变分别与结核分枝杆菌耐受INH、EMB和SM的药物密切相关[6]。本研究采用比例药敏法选取101株MDR-TB，发现SM耐药率为69.3%，EMB耐药率为51.4%，远高于我国非MDR-TB的耐药率[7]，这可能是这两种药物在临床使用频率过高有关。为进一步探究合肥地区MDR-TB的耐药基因位点表达情况，同时挖掘有无新的基因型及突变位点，本研究采用PCR+反向点杂交(RDB)相结合的基因芯片技术和测序法检测101株MDR-TB的INH、SM、EMB的耐药基因位点表达情况。结果发现101例MDR-TB中基因芯片法和测序法分别检出95例和98例INH耐药相关基因突变，另外几例没有检出耐药相关基因位点突变，可能存在本研究之外的基因型及位点或其他耐药机制，与INH耐药的相关基因很多，最常见的有katG、inhA、ndh、oxyR-ahpC、kasA等[8]。本研究中katG基因315位点和inhA基因-15位点均具有较高的突变率，提示INH耐药相关基因以katG基因315位点和inhA基因-15位点为主，与国内文献报道一致[9-10]。测序法检测结果提示还存在其他基因型及位点表达，本研究还检测出2例katG基因463位点突变，1例inhA基因-8位点突变，1例inhA基因-17位点突变，特别是检测出10例oxyR-ahpC基因-12位点突变，突变率为10.2%,8例oxyR-ahpC基因-10位点突变，突变率为8.2%。提示实验室运用分子生物学手段进行INH耐药基因位点检测时应重视oxyR-ahpC基因及其位点突变的检测。SM是氨基环醇糖苷类抗菌药物，研究表明，编码小亚基核糖体蛋白s12的rpsl和编码16sRNA的rrs基因突变是MTB耐SM的主要分子机制[11]。本研究检出SM耐药相关基因rpsL，其常见突变位点为43和88，其中以43位点突变为主，突变率分别为89.0%(基因芯片法)和86.8%(测序法)；测序法同时又检出4例rrs基因512位点突变，突变率为5.9%，6例rrs基因513位点突变，突变率为8.8%，6例rrs基因516位点突变，突变率为8.8%，说明rrs也是SM耐药的一个常见耐药相关基因，这与其他研究报道观点一致[11]。本研究中约有5%SM耐药株没有检出rpsl和rrs基因位点突变，是否存在其他耐药机制或耐药相关基因有待进一步研究。EMB是治疗MDR-TB的重要药物，本文中EMB的耐药率高达51.4%，与国内有些研究报道一致[12-14]。EMB的耐药机制研究显示，结核分枝杆菌EMB耐药性的产生主要与embCAB基因座突变有关，且以embB突变为主[15]，有研究报道在EMB耐药菌株中embB306位点突变率约为68%[16]。本研究检出embB306位点的突变率为88%，明显高于其他研究报道的突变率，可能系研究的对象为耐多药分枝杆菌有关[16]；测序法同时检出2例embB406位点突变，提示embB406位点也可能是耐药相关基因位点之一。