王 慧，许剑兰，郑成芳，陈灵芝

(海南西部中心医院感染科，海南儋州 571700)

慢性乙型肝炎(CHB)是由于感染乙型肝炎病毒(HBV)并在患者体内复制而引起机体自身免疫反应，造成肝脏炎症损伤的一种全球范围内的感染性疾病。CHB患者主要表现为腹胀、恶心、身体乏力、肝区疼痛、脾大等临床症状[1]。HBV感染后患者病情可逐渐恶化形成肝硬化、肝衰竭、肝癌等严重肝脏疾病，损伤患者生命健康。据有关研究报道[2]，HBV侵入机体之后，在人体肝脏细胞内自我复制，诱导机体免疫反应，引起免疫细胞辅助性T淋巴细胞17(Th17)、调节性T淋巴细胞(Treg)、Th2、Th1等的共同作用，其中Th1、Th2共同调控肝脏免疫应答，Th1/Th2水平失衡影响肝脏纤维化发生发展进程。Th17、Treg共同起源于T淋巴细胞，近几年发现其也与肝脏炎症反应、肝脏纤维化进程相关，Th17主要参与炎性反应，Treg主要参与抗炎反应，但其具体作用机制尚待研究[3]。还有研究表明结缔组织生长因子(CTGF)具有分泌特性，其作为转化生长因子(TGF)的下游效应介质，能够与TGF-β共同诱导肾间质纤维化的形成[4]。但关于CTGF、Th17/Treg在CHB中的表达情况及与肝脏纤维化的的研究鲜有报道，因此本研究主要分析CTGF与肝纤维化、Th17/Treg平衡在CHB患者的表达情况及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究收集2016年6月至2018年6月在本院确诊的CHB患者资料146例(研究组)为研究对象，其中男76例，女70例，年龄30～76岁，平均年龄(45.64±10.85)岁，根据慢性乙型肝炎防治指南[5]将肝纤维化程度将其分为S0期34例，S1期30例，S2期28例，S3期29例，S4期25例。纳入标准：(1)符合2010年中华人民共和国“慢性乙型肝炎防治指南”的诊断标准[5]；(2)患者及家属均知情且签署同意书。排除标准：(1)合并其他病毒重叠感染或混合感染；(2)近1个月服用治疗CHB的药物者；(3)妊娠期、哺乳期妇女；(4)合并严重心肺功能障碍患者；(5)近期患有全身性炎症疾病和自身免疫性疾病者；(6)近期有细菌、病毒等感染病。本研究经本院伦理委员会批准。另选取同期在本院体检的健康者90例作为对照组，其中男48例，女42例，年龄32～75岁，平均年龄(45.05±11.35)岁，对照组所有研究对象均经过血常规、生化分析、B超检测等证明无肝脏疾病。2组研究对象性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 仪器与试剂 丙氨酸氨基转移酶(ALT，批号：20150619)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST，批号：20150822)、总胆红素(TB，批号：20150625)试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；CTGF、白细胞介素-17(IL-17)试剂盒购自美国ADL公司。全自动生化分析仪型号为7600，购自日立公司；酶标仪型号为550，购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪型号为MoFloAstrios EQ，购自美国贝克曼库尔特有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的采集与处理 清晨空腹采集本研究所有受试者静脉血6 mL，分为两份，一份于室温下静置20 min，以2 500 r/min转速离心15 min，吸取上层血清分装于无菌管中，置于-80 ℃冰箱中保存备用；一份置于肝素钠采血管中，用于Th17和Treg的检测。

1.3.2 肝功能指标的检测 肝功能指标ALT、AST、TB水平，均采用日立7600全自动生化分析仪测定，操作步骤严格按照说明书进行。

1.3.3 血清CTGF、IL-17水平的检测 采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清CTGF、IL-17的水平，具体检测步骤按照试剂盒说明书进行，酶标仪进行检测记录波长450 nm时的A值，绘制标准曲线计算待检样品浓度。

1.3.4 Th17和Treg的检测 取肝素钠采血管中的血液，梯度离心提取外周单个核细胞(PBMC)。参照流式细胞仪操作说明对细胞进行固定、染色、透化，分别对Th17、Treg 进行胞内染色，1h内使用流式细胞仪检测，计算Th17、Treg百分率及Th17/Treg比值。

2 结 果

2.1 两组临床资料比较 两组研究对象性别、年龄、体质量指数(BMI)比较差异均无统计学意义(P>0.05)；研究组ALT、AST、TB均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 2组血清CTGF、IL-17水平及Th17、Treg百分率比较 与对照组相比，研究组CTGF、IL-17水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，研究组Treg百分率降低(P>0.05)，Th17百分率显著升高(P<0.05)，Th17/Treg比值显著升高(P<0.05)，见表2。

2.3 不同纤维化程度血清CTGF、IL-17水平及Th17、Treg百分率比较 随着纤维化程度加深，血清CTGF、IL-17水平及Th17、Th17/Treg比值逐渐升高，Treg百分率逐渐降低，其中S1～4期血清CTGF、IL-17水平及Th17、Th17/Treg比值均显著高于S0期(P<0.05)，Treg百分率均显著低于S0期(P<0.05)，见表3。

表1 两组临床资料比较

表2 2组血清CTGF、IL-17水平及Th17、Treg百分率比较

表3 不同纤维化程度患者血清CTGF、IL-17水平比较

2.4 血清CTGF、Th17/Treg水平与IL-17、Th17、Treg相关性 Pearson相关性分析，CTGF与Th17/Treg、IL-17、Th17呈正相关(r=0.670、0.603、0.618，P<0.05)，与Treg呈负相关(r=-0.609，P<0.05)；Th17/Treg与IL-17、Th17呈正相关(r=0.703、0.645，P<0.05)，与Treg呈负相关(r=-0.683，P<0.05)；Treg与IL-17、Th17呈显著负相关(r=-0.598、-0.624，P<0.05)，Th17与IL-17呈正相关(r=0.651，P<0.05)。

2.5 ROC分析CTGF、Th17/Treg比例对CHB患者的诊断意义 ROC分析检测CTGF、Th17/Treg表达水平对CHB的诊断价值，结果显示CTGF灵敏度为68.9%、特异度为56.7%、截断值为24.191 5 ng/mL、ROC曲线下的面积(AUC)为0.695；Th17/Treg灵敏度为77.8%、特异度为67.8%、截断值为0.853 1，AUC面积为0.753。见图1、表4。

注：A为CTGF对CHB的诊断价值；B为Th17/Treg表达水平对CHB的诊断价值

图1 血清CTGF、Th17/Treg的ROC曲线图

3 讨 论

HBV在各国都有分布，其可通过血液、性接触、医源接触等途径传播，其传播途径较为广泛且疾病治愈困难。目前每年有大约100万患者死于HBV感染，近年来随着HBV感染人数的增多，对CHB的预防和治疗成为全球性亟待解决的公共健康问题。CHB发病机制复杂，目前研究者认为其与免疫系统紊乱密切相关，CD4+细胞亚群Th1/Th2失衡被认为是引起肝脏损伤的主要原因[6]。近年来随着研究的深入，逐渐发现CD4+细胞亚群的Th17、Treg在CHB的免疫反应中也发挥重要作用。孙强等[7]研究发现，CHB患者外周血Th17比例及IL-17显著高于对照组，认为Th17在CHB患者机体内具有免疫激活作用。STOOP等[8]研究表明，Treg细胞在CHB患者外周血中的比例显著低于对照组。CTGF是TGF-β的下游效应介质，主要由肝星状细胞分泌，IL-17可以激活肝星状细胞。故本研究检测分析CHB患者中血清CTGF、Th17、Treg水平，以期为CHB的诊治提供理论依据。

Th17细胞是在自身免疫性疾病的研究中发现的辅助性T细胞，具有较强的促炎作用，其主要生物学作用通过IL-17表达，其主要分泌IL-17，IL-6、IL-21等炎症因子[9]。在HBV感染后，Th17细胞分泌IL-17作用于靶细胞，刺激炎症介质释放，诱导机体炎症反应，损伤肝脏组织[10]。研究表明，Th17还可促进IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等的表达，引起组织细胞的浸润促进炎症的发生发展[11]。Treg细胞可向CD4+T细胞、B细胞、NK细胞等释放TGF-β、IL-10等抗炎因子抑制自身免疫反应，减弱炎症反应对组织的损伤[12]。近年来研究表明，在CHB患者中，Treg细胞明显降低，其能够抑制HBV特异性CD8+的增殖，预防过度免疫应答引起的肝脏组织细胞损伤[13]。机体内Th17诱导炎症发生，Treg抑制炎症反应，二者共同维持机体的免疫状态。Th17与Treg在正常机体状态下处于相对平衡，TGF-β抑制效应T细胞的活化、诱导Treg细胞的增殖；在炎症反应中IL-6抑制Treg细胞的增殖，诱导Th17细胞的增殖，导致Th17/Treg比值失衡，引起全身免疫应答异常[14]。本研究结果显示患者Th17细胞频率显著升高，Treg细胞频率降低，Th17/Treg比值升高。ALT、AST、TB作为检测肝脏功能重要的指标，其水平显著升高表明肝脏受到严重损伤，可能与病毒性肝炎引起的炎症作用相关。研究表明，慢性肝炎患者IL-17水平与ALT呈正相关[15]。本研究中，ALT、AST、TB水平均显著升高，表明其与CHB疾病发展相关。Pearson相关性分析显示Th17/Treg与患者血清炎性因子IL-17呈显著正相关，说明Th17、Treg可能与CHB的发生及发展过程相关。ROC曲线分析显示Th17/Treg的AUC面积为0.753，截断值为0.853 1，表明Th17/Treg比值大于0.853 1时有可能患有CHB，其表达水平可作为临床早期诊断CHB的理论依据。

CTGF属于CNN多肽家族，是TGF-β的下游效应介质，能够诱导纤维母细胞基因的表达、诱导成纤维细胞增殖、分化[16]。肝脏纤维化是机体肝脏组织受到长期炎症刺激产生的病理状态[17]。机体正常状态下，TGF-β表达量少，在肝脏纤维化过程中，其在纤维间隔、肝窦内皮细胞等表达升高，CTGF也表达升高，且随纤维化程度升高表达增加，CTGF的高表达与肝脏纤维化程度密切相关[18]。ABOU-SHADY等[19]研究表明肝硬化组织标本中CTGF mRNA表达升高，提示其与肝纤维化相关。研究表明IL-17可以激活肝星状细胞，而CTGF主要来源于肝星状细胞，在HBV感染的患者中Th17细胞分泌IL-17显著升高，上调CTGF表达[20]。本研究结果显示患者血清CTGF水平显著升高，CTGF与IL-17、Th17呈显著正相关，与Treg呈显著负相关，CTGF与Th17/Treg比值呈显著正相关，表明IL-17的增加促进CTGF的分泌。CTGF与Th17/Treg平衡在CHB的发展过程中具有重要作用。ROC分析显示CTGF的AUC面积为0.695，截断值为24.191 5 ng/mL，表明CTGF可作为CHB临床早期诊断指标。

4 结 论

CHB患者血清CTGF随肝纤维化程度加重而增加，CTGF与Th17/Treg呈显著正相关，且二者均可作为CHB患者的早期临床检测指标，但本研究由于样本数量较少，未对远期疗效进行随访，存在不足之处，今后将重视扩大样本数量进行深入研究。