张佳婕，蔡 强，邓红艳，李引钰，薛富海，盛尚春△

(1.成都大学附属医院检验科，四川成都 610081；2.宜宾市第二人民医院儿科，四川宜宾 644000)

原发性胆汁性肝硬化(PBC)，又称为原发性胆汁性胆管炎，是慢性自身免疫性肝脏疾病的一种，其病因不明，主要特点是肝内胆管进行性破坏，从而导致胆汁淤积，并可进展为肝硬化或肝功能衰竭，甚至是肝细胞癌[1]。PBC一般可分为临床前期、无症状期、症状期和失代偿肝硬化期4个阶段，该病可从无症状期迁延数年甚至数十年[2]。大约20%的PBC患者早期表现为疲劳和瘙痒[3]，由于该病早期症状与病毒性肝炎相似，且二者都可能出现血清生化指标异常，故常容易漏诊或误诊。目前，该病尚无理想的治疗方法，疾病早期使用熊去氧胆酸(UDCA)可以改善血清生化指标延缓病情[4]，但是约三分之一的患者对UDCA表现为不耐受，而在失代偿期常规治疗手段已无力，只有肝脏移植才能挽救患者生命[5]，所以对该病的诊断和治疗越早越好。目前，已公认PBC患者血清中常常出现抗线粒体抗体(AMA)，尤其以M2型抗体(AMA-M2)阳性为主要特征[5]。因此，检测出PBC的特异性自身抗体和生化指标的变化对诊断和进一步治疗有重要作用。本研究旨在探讨自身抗体及生化指标在PBC诊断中的价值，为临床诊断提供实验室依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 根据临床诊疗结果及实验室检测指标进行回顾性分析，选取2017年1-12月成都大学附属医院住院治疗的PBC患者41例作为PBC组，其中男6例(14.63%)，女35例(85.37%)，年龄38～88岁，平均(56.24±14.72)岁。另收集病毒性肝炎患者65例作为病毒性肝炎组，包括乙型肝炎35例，丙型肝炎18例，戊型肝炎6例，甲型肝炎6例，其中男29例(44.62%)，女36例(55.38%)，年龄26～88岁，平均(54.28±17.69)岁。同期在医院体检健康者50例作为健康对照组，其中男21例(42.00%)，女29例(58.00%)，年龄20～76岁，平均(50.92±16.02)岁。各组性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 病例纳入诊断标准 PBC的临床诊断：参照2009年美国肝病研究协会(AASLD)对PBC的诊断建议[6]。符合3个标准中的两项则可诊断PBC:(1)反映胆汁淤积的生化指标如碱性磷酸酶(ALP)升高；(2)患者血清AMA或AMA-M2阳性；(3)患者血清AMA及AMA-M2阴性，但肝穿刺病理符合PBC。慢性乙型肝炎的诊断符合2015年慢性乙型肝炎防治指南[7]；丙型肝炎的诊断符合2015年丙型肝炎防治指南[8]；戊型肝炎和甲型肝炎的诊断分别符合戊型病毒性肝炎诊疗规范[9]和甲型病毒性肝炎诊断标准[10]。

1.3 仪器与试剂 OLYMPUS BX51荧光显微镜、EUROBlotMaster 44半自动免疫印迹仪、EUROLINEScan扫描仪、OLYMPUS AU5400全自动生化分析仪。间接免疫荧光法采用欧蒙(杭州)医学实验诊断有限公司生产的自身抗体谱IgG检测试剂盒。免疫印迹法检测试剂采用欧蒙(杭州)医学实验诊断有限公司生产的抗肝抗原谱抗体IgG试剂盒。生化指标采用中生北控生物科技有限公司生产的相应检测试剂盒。

1.4 方法

1.4.1 样本采集 符合上述标准的人群采用真空血清采血管按常规采血步骤采空腹血3 mL，1 h内以3 000 r/min离心10 min，血清完全分离后检测。

1.4.2 间接免疫荧光法 自身抗体谱IgG试剂生物载片上包被4种基质抗原：Hep-2细胞(人)、猴肝、大鼠胃、大鼠肾，可检测抗核抗体(ANA)、AMA、抗平滑肌抗体(ASMA)和抗肝肾微粒体抗体(LKM)。按照试剂盒说明书操作，每批次均设置试剂盒自带的阴性对照和阳性对照，在荧光显微镜下观察特异性绿色荧光，血清稀释度≥1∶100判断为阳性。

1.4.3 免疫印迹法 抗肝抗原谱抗体IgG试剂盒可检测AMA-M2、2-酮酸脱氢酶复合体(M2-3E，又名BPO)、肝肾微粒体抗体(LKM-1)、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体(SLA/LP)、抗肝细胞溶质抗原1型(LC-1)抗体。血清1∶100稀释，用EUROBlotMaster 44半自动免疫印迹仪按照试剂盒说明书操作，每批次均设置阴性对照和阳性对照，实验结果通过扫描仪扫描膜条，用EUROLINEScan软件判断阴阳性。

1.4.4 酶比色法 OLYMPUS AU5400全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、ALP、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、总胆红素(TBil)和胆汁酸(TBA)。所有实验步骤均按照说明书严格操作。

1.5 统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行统计学处理。计数资料以例数或百分比表示，阳性率比较采用χ2检验；计量资料偏态分布，以[M(P25,P75)]表示，两个独立样本的比较采用Mann-WhitneyU检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 荧光核型检出率 PBC组ANA阳性率为97.50%，其中10例(24.39%)荧光强度为1∶100，23例(56.10%)荧光强度为1∶320，7例(17.07%)荧光强度为大于或等于1∶1 000。荧光核型以核颗粒型和胞浆颗粒型为主,检出的核型分别为胞浆颗粒型56.10%(23/41)、核颗粒型21.95%(9/41)、着丝点型7.32%(3/41)、核膜型7.32%(3/41)和核点型4.88%(2/41)。见图1。以上单一核型占75.61%(31/41)，混合核型占21.95%(9/41)，分别为核颗粒型与胞浆颗粒型混合(3/41)、核膜型与胞浆颗粒型混合(4/41)、核颗粒型与着丝点型混合(2/41)。病毒性肝炎组和健康对照组ANA为低滴度(1∶100)核颗粒型。PBC组ANA及AMA阳性率高于病毒性肝炎组和健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，病毒性肝炎组与健康对照组ANA与AMA比较，以及ASMA和LKM各组间两两比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组间接免疫荧光法检测结果比较[n(%)]

2.2 相关自身抗体检出率 PBC组AMA-M2、M2-3E检出率分别与病毒性肝炎组、健康对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；病毒性肝炎组与健康对照组AMA-M2与M2-3E比较，以及LKM-1、SLA/LP、LC-1各组间两两比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。PBC组至少1种抗体为阳性的患者占92.68%(38/41)，1例患者表现为AMA-M2和SLA/LP同时阳性。见表2。

注：A核颗粒型；B核点型；C核膜型；D着丝点型；E胞浆颗粒型；F核颗粒+胞浆颗粒型；G核膜+胞浆颗粒型；H核颗粒+着丝点型

图1 PBC患者ANA荧光核型

2.3 各组生化指标检测结果比较 PBC组GGT、ALP水平显著高于病毒性肝炎组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组间其余指标ALT、AST、TBil、TBA水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。PBC组、病毒性肝炎组与健康对照组ALT、AST、GGT、ALP、TBil和TBA水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。PBC组中，AMA-M2阴性组和AMA-M2阳性组之间生化指标比较，M2-3E阴性组和M2-3E阳性组之间生化指标比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表3 各组生化指标检测结果比较[M(P25,P75)]

续表3 各组生化指标检测结果比较[M(P25,P75)]

注：U1(P1)值为PBC组与病毒性肝炎组比较；U2(P2)值为PBC组与健康对照组比较；U3(P3)值为病毒性肝炎组与健康对照组比较

表4 PBC组中各亚组生化指标比较[M(P25,P75)]

3 讨 论

流行病学调查表明PBC主要发病的人群为中年女性，男女发病比例为1∶12[5]。PBC患者有两类自身抗体，ANA类和AMA类，包括AMA-M2等亚型[11]。虽然ANA是非特异性自身抗体，但有些荧光核型可高频率出现在某些疾病中，因此，ANA的检测在许多自身免疫性疾病的诊断中起着重要的作用[12]。本研究中ANA阳性率为97.50%，阳性率高出报道28.3%[13]。有研究报道PBC中常见的ANA核型为着丝点型、核膜型和核点型，其中核膜型ANA是PBC的一个特异性血清学指标，它的出现有助于PBC的诊断[14]。本研究中ANA核型依次是胞浆颗粒型、核颗粒型、着丝点型、核膜型和核点型，与上述报道不一致，与周晓冬等[4]的报道基本相符。本研究中单一核型与混合核型比为31∶9，与王晗等[15]报道的混合核型高于单一核型不符，混合型的出现可能与重叠综合征有关。上述结果分析原因， 10名(24.39%)患者中查见1∶100低滴度荧光核型都是胞浆颗粒型和核颗粒型，可能与实验本底偏高或者与人员判读差异有关，导致荧光滴度偏高，出现ANA假阳性和荧光核型的差异，也可能与实验方法、试剂、地域、人种差异及患者治疗阶段药物的影响有关。此外，核膜型ANA靶抗原是gp210，核点型ANA靶抗原是sp100，并且二者主要出现在AMA阴性PBC患者体内[11]，本研究间接免疫荧光法检测AMA阳性率为73.17%，仅有26.83%患者AMA是阴性，故检测到的核膜型和核点型ANA数量相对较少。此外，其他自身免疫性疾病患者、伴有肿瘤、内分泌性疾病等其他基础疾病患者甚至健康老年人体内也可查见低滴度ANA，因此，高荧光强度ANA提示患者可能有自身免疫性疾病，可作为PBC的筛查指标。

AMA可在多种自身免疫性疾病和感染性疾病中出现[16]，但其主要存在于PBC患者体内。AMA有9个亚型，其中4个与PBC相关联：AMA-M2，AMA-M4，AMA-M8和AMA-M9，其中95%的PBC患者中可发现AMA-M2[17]。AMA-M2是诊断PBC的标志性抗体，甚至在缺乏临床症状，无胆汁淤积，或者是ALP水平正常的情况下，也可检出AMA-M2，因此，有学者提出将AMA-M2直接作为PBC的诊断标准[18]。BPO是由天然M2抗体的靶抗原丙酮酸脱氢酶复合体E2 亚基(PDC-E2)与酮戊二酸脱氢酶复合体E2 亚基及丙酮酸脱氢酶复合体侧链E2 亚基三者组成的融合蛋白[11]。研究报道AMA-M2和M2-3E阳性率分别为70.31%和81.25%[4]，本研究中二者阳性率比以上报道高，但M2-3E阳性率(85.37%)比AMA-M2阳性率(80.49%)高与文献[4]报道结果相符。因此AMA-M2与M2-3E联合检测可提高PBC的阳性率，尤其是M2-3E单独阳性患者要高度怀疑PBC，最好结合肝组织活检有利于疾病诊断。若能采用同时包被有AMA-M2、M2-3E、gp210和sp100抗原的条带进行检测，更能降低漏诊率，提高检测灵敏度和特异度。本研究中1例患者除了检出AMA-M2、M2-3E，还检出了SLA/LP抗体，SLA/LP是诊断AIH的特异性标志物，说明该患者有重叠综合征。

PBC主要病变是肝内胆管的进行性破坏从而导致胆汁淤积，因此，反映胆汁淤积的生化指标会出现不同程度的升高。病毒性肝炎是由肝炎病毒引起的以肝脏炎症和坏死为主的传染病。本文中PBC组与病毒性肝炎组肝功指标均出现不同程度的升高，说明二者都出现了肝细胞损害，但PBC组GGT及ALP显著高于病毒性肝炎组，说明PBC患者肝内胆管损害和胆汁淤积更加严重。有研究指出，血清ALP升高不仅是肝内胆汁淤积的指标，更可以反应PBC的严重程度。也有研究指出ALP、TBil、TBA血清浓度与PBC的发展甚至恶化有显著联系[19-21]。抗着丝点抗体阳性患者可能出现更高的ALP水平，更易发展为肝硬化、门脉高压和肝衰竭[22]。有报道指出AMA阳性患者与AMA阴性患者在临床表现、血清生化特征、组织病理特征、病程进展或对UDCA治疗的反应无明显区别，只是AMA阴性PBC患者的预后更差[17]。本研究比较了AMA-M2阴/阳性组和M2-3E阴/阳性组之间的生化指标，发现AMA-M2、M2-3E与肝功能损害无相关性，与其他研究报道结果相符[4]。

4 结 论

PBC患者可检测出多种ANA荧光核型，AMA、AMA-M2、M2-3E等自身抗体在PBC患者中有较高检出率，特别是AMA-M2与M2-3E联合检测可提高PBC阳性率，尤其是M2-3E单独阳性患者要高度怀疑PBC。若上述任何一种抗体单独出现并且生化肝功指标升高，特别是ALP、GGT显著升高，都提示可能是PBC早期。此外，要高度重视极少数预后更差的患者，其AMA-M2和/或M2-3E抗体阴性但肝功指标异常升高，需要结合组织病理结果等进一步检查才能帮助临床及早对PBC患者作出诊断和鉴别诊断，降低误诊和漏诊，使患者得到合理及时的治疗，改善预后。