高振轩，谌志筠，何秋水

(1.首都医科大学基础医学院2015级五年制临床医学专业，北京 100069； 2.首都医科大学基础医学院病原生物学系，北京 100069；3.芬兰图尔库大学医学微生物和免疫学系，图尔库 20520)

百日咳是由百日咳杆菌引起的一种急性呼吸道传染病，人群普遍易感。百日咳以阵发性痉挛性咳嗽、咳嗽后呕吐、鸡鸣样吼声为典型临床症状，可持续2～3个月，婴幼儿患百日咳可导致严重后果，是我国法定乙类传染病。百日咳疫苗的接种覆盖率虽已很高，近年来，全球许多国家和地区的百日咳发病率却有明显上升的趋势，局部地区甚至出现暴发流行，称为“百日咳再现”[1-2]。除了临床医师诊断意识的提高、先进的实验室方法[细菌培养、特异的百日咳杆菌核酸放大方法和血清百日咳毒素(pertussis toxin，PT)特异抗体检测法等]的使用以外，疫苗接种后产生的免疫力的衰减和百日咳杆菌变异被认为是导致“百日咳再现”最重要的原因之一。大量研究证明，病原菌在不同的免疫接种策略下会出现不同程度的变异以适应选择压力，称为“病原菌适应现象”[3-7]。近年来，在无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccines，ACVs)普及率较高的国家中，百日咳杆菌黏附素蛋白(pertactin，Prn)缺失株的出现和增加，引起了全球极大关注[8]。我国ACVs的使用和普及较晚[3,9]，对Prn缺失株还缺乏较为系统的研究和认识。现就近年来国内外百日咳杆菌Prn缺失株的研究进展进行综述。

1 百日咳疫苗的种类及特点

1.1 全球百日咳疫苗的种类和特点 百日咳疫苗主要分为全细胞百日咳疫苗(whole-cell pertussis vaccines，WCVs)和ACVs两种。WCVs的主要制作方法，是将百日咳杆菌全菌体灭活后，再与适当佐剂配伍。20世纪20年代，经临床试验证实有效性后，WCVs在全球范围内被广泛用于儿童初次免疫及加强免疫。在实施扩大免疫计划的国家和地区，随着接种覆盖率的提高，百日咳发病率下降超过90%，一度得到了很好的控制[10]。但随着时间的推移，WCVs的缺点逐渐显现。比如，不同批次间的质量不易把控，接种后可能出现严重的全身反应，甚至出现脑炎、癫痫等，对婴幼儿可能造成严重的后果甚至死亡[8,10]。为了降低接种疫苗后的不良反应发生率，自20世纪80年代，日本最先开始使用ACVs替代WCVs。ACVs的制作方法，主要是通过提纯去掉一些能引起不良反应的无用的物质，保留具有免疫原性的百日咳杆菌抗原成分。目前，世界上使用的ACVs包括以下几种。ACV1：仅含PT一种抗原。ACV2：含PT和丝状血凝素(filamentous hemagglutinin，FHA)两种抗原。ACV3：含PT、FHA和Prn三种抗原。ACV5：含PT、FHA、Prn、菌毛蛋白2(fimbriae，FIM2)和FIM3五种抗原。研究表明，含有Prn的ACVs比不含Prn的ACVs能诱导更强的免疫保护力，因此国际上使用的ACVs多含有Prn成分[11]。目前普遍使用的是ACV3。

1.2 我国ACVs的种类和特点 我国自20世纪60年代开始应用WCVs，2007年开始使用ACVs替代WCVs，并于2012年完成ACVs大面积覆盖接种[9,12]。根据《中华人民共和国药典》(三部)的要求，我国采用的各ACVs生产菌株以CMCC 58003(CS株)为主，采用共纯化生产工艺，经过盐析和离心收集PT、FHA，并作为有效组分制成ACVs原液，之后与破伤风类毒素和白喉类毒素合并并稀释[13]。由于两种抗原成分是共同提取的，因此缺乏分别定量的工作，且有可能含有其他百日咳杆菌来源的抗原成分[14]。

1.3 ACVs诱导的免疫应答特点及可能后果 虽然ACVs的接种在降低不良反应发生率的同时保留了疫苗的免疫原性，诱导单个抗原的特异性抗体的滴度较高，但大量研究证实，ACVs诱导的免疫应答仅针对少数抗原，不如WCVs广泛；接种ACVs后的免疫保护力持久性相比WCVs进一步下降；ACVs的使用有可能导致疫苗所含抗原表达缺失的菌株的流行[8,15]。

2 “百日咳再现”及可能原因

20世纪50年代以来，百日咳疫苗的使用很大程度上降低了百日咳的发病率和死亡率。尽管如此，百日咳仍然是全球范围内最流行的疫苗可预防性疾病之一。近年来，在很多发达国家和发展中国家，百日咳的发病率呈现明显上升趋势。英国、美国、澳大利亚、比利时等国家都有过疫情暴发的报道[2,16-18]。我国的百日咳疫苗接种覆盖率从1983年的58%上升到了2012年的99%，1990年以来，我国百日咳报告发病率低于十万分之一，防控措施取得了良好成效。但是，据我国国家卫生健康委员会统计，2015年、2016年及2017年全国百日咳报告发病数分别为6 658例、5 681例和10 390例，相比2014年以前(报告发病数在1 612～3 408例不等)，近三年的报告发病数明显增多。截止到2018年底，已经报告百日咳22 057例[3,19]。

导致“百日咳再现”的原因，包括临床医师对疾病重视程度增加，诊断意识提高；先进的实验室诊断技术的推广应用，监测系统敏感性提高；接种疫苗后的免疫力衰减导致青少年及成人发病人群增加，成为婴幼儿百日咳感染的重要传染来源；百日咳杆菌变异影响疫苗接种的有效性等[20]。

3 Prn缺失株的发现及流行现状

3.1 “Prn缺失株”的发现和流行 值得关注的是，近几年出现的流行菌株中，有的不表达ACVs所包含的抗原成分，PT、Prn、FHA以及FIM等均可缺失[21]，而其中又以Prn缺失最为常见，这类菌株被称为“Prn缺失株”。Prn缺失株于2003年在法国被首次发现，之后越来越多的Prn缺失株从各个国家的临床流行菌株中被发现，甚至可能造成百日咳暴发流行[12]。根据2014年的一项加拿大九省菌株样本调查研究显示，最早在2011年收集的标本中，仅Ontario一个省出现Prn缺失株，而到2012年就已增加为两个省，Ontario省的Prn缺失株占比更是达到了60%[22]。根据澳大利亚的一项研究报道，2008—2012年澳大利亚百日咳暴发时期收集的菌株中，Prn缺失株的比例从最初的5%迅速上升至78%[23]。2012年，在美国华盛顿州百日咳大暴发时期分离的菌株中，Prn缺失株所占比例超过了60%[12]，可见Prn缺失株在某些发达国家的流行趋势已经十分严峻。

我国目前尚未发现Prn缺失株。但据近期的一篇国内的研究报道，2013—2014年收集的99个病例样本中，出现了以prn2基因型为主的菌株，与ACVs抗原的基因型不同[7]。因此，是否会出现Prn缺失株，仍值得我国在百日咳预防工作中提高警惕，并加强对我国流行菌株分子生物学特征的监测，重视国家和地区以Prn缺失株为首的疫苗抗原缺失菌株的流行问题。

3.2 Prn缺失株的特点 Prn是一种外膜表面相关蛋白，属于自转运蛋白家族，具有较高的免疫原性，是很多ACVs的重要成分之一。Prn蛋白是由prn基因编码的一个分子量为93 000的前体多肽，经过水解后获得的一个分子量为63 000的蛋白，拥有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列三联肽结构，可促进百日咳杆菌对宿主细胞的黏附作用，使之侵入到呼吸道黏膜纤毛上皮细胞和肺泡巨噬细胞，从而增强百日咳杆菌的侵袭力。同时，Prn还具有逃避中性粒细胞清除以及免疫调节的作用[8,24]。

根据美国、澳大利亚等国学者的大量临床研究和实验室数据显示，与表达Prn的菌株相比，Prn缺失株对宿主的侵袭力和致病性并无明显的差别。在6个月以下的婴儿和动物模型中，Prn缺失株的毒力、致病性等与正常菌株相比无明显差异，对引起常见的百日咳临床症状(咳嗽、上呼吸道感染、百日咳呕吐等)也无明显影响[15,23,25-26]。在最近的一项研究中，将国际标准菌株Tohama Ⅰ型衍生菌株敲除编码Prn的基因，所得到的Prn缺失株与原菌株相比，可刺激人体和小鼠的树突状细胞产生更多促炎性细胞因子，增加细胞的死亡。但从临床分离出的 Prn缺失株却并未观察到这个现象[27]。因此可以推断，百日咳杆菌中Prn的作用可以被其他毒力因子代偿。但具体的分子机制尚不十分明确[8,15,26]。

3.3 Prn缺失株出现的可能的分子机制 Prn缺失株产生的可能的分子机制主要包括：prn启动子倒位；IS481插入序列的插入；prn基因单核苷酸多态性导致引入终止密码子，使蛋白翻译提前终止；单核苷酸插入导致移码突变；prn部分基因缺失，以及prn部分基因缺失后被另一片段取代[15,28]。其中，以IS481序列插入最为常见。原因可能是IS片段对于百日咳杆菌的基因复制和删除有着极大的潜在影响，IS片段的插入可以导致伪基因的产生，从而“剔除”那些与感染侵袭等因素无关的蛋白，达到适应进化的目的[9,29]。

3.4prn表达缺失的分布特点 基因序列显示，百日咳杆菌prn呈多态性，包括13个不同基因型，从prn1到prn13。国内外用来生产疫苗的菌株表达prn1或prn7，但大多数临床分离株表达prn2[30-31]。导致Prn表达缺失的基因突变可在百日咳杆菌各个谱系独立产生。在美国，一项对1935—2012年百日咳流行菌株进行脉冲场凝胶电泳分型的调查显示，与Prn表达菌株中占领绝对优势的CDC013菌株不同，CDC002和CDC237菌株占据着Prn缺陷菌株的统治地位，占比达到55%，CDC013菌株却只占5%[32-33]；而另一项调查证明，在日本传播的Prn缺失株是克隆扩增的结果，与在法国发现的Prn缺失株的分子机制有明显不同[34]。在日本发现的Prn缺失菌株多为prn1型，法国[34]、美国[33]则多为prn2型。有研究显示，部分日本Prn缺失株的基因突变类型在世界范围内没有检测到近源的祖先菌株，表明这一谱系的Prn缺失菌株仅在日本原发出现[15,23,34-36]。另外，一些地区的流行菌株基因型会呈现出与国家流行菌株有所不同的现象，提示不同地区的百日咳杆菌基因型的变化导致的Prn缺失株具有地区特异性[36]。这也可能是百日咳疫情在某些地区出现暴发的原因。

3.5 Prn缺失株出现的原因 相似的人群选择压力，特别是疫苗免疫策略则会使Prn缺陷菌株固定在特定人群中，并造成暴发和流行。美国、澳大利亚和法国等国的研究发现，Prn缺失株暴发流行的现象与普及ACVs接种的时间和所含抗原成分关系密切(表1)。在澳大利亚的一项研究中，研究者用同等剂量的Prn表达菌株和Prn缺失株同时感染未免疫和ACVs免疫后的幼年小鼠。在未免疫的小鼠中，Prn表达菌株占据了绝对地位，而经过ACVs免疫后的小鼠中，Prn缺失株却占据了统治地位[37]。根据欧盟一项比较1998—2012年不同国家临床分离株的研究，各个采取ACVs免疫策略的国家中，只有丹麦未发现Prn缺失株。值得注意的是，丹麦的ACVs中仅含有PT一种成分，因此Prn缺失株很可能在这种免疫人群中没有选择优势[15]。在日本，Prn缺失株自1997年开始出现，2005—2007年占临床分离菌株的比例达到41%，2008—2010年为35%。之后，Prn缺失株所占比例开始逐年下降，2011—2013年为25%，2014—2016年为8%。值得注意的是，自2012年起，日本开始使用不包含Prn的ACVs[38]。根据美国的一项研究，Prn缺失株与Prn表达株对于临床应用的抗生素的敏感性没有显著差异，因此可以基本排除临床治疗方案对于Prn缺失株产生的影响[39]。所以，Prn缺失株的出现，可能是含有Prn成分的ACVs造成的免疫环境改变，对菌株产生新的选择压力的结果。

综上所述，Prn缺失株的流行和暴发实际上是菌株自身的变异和宿主人群免疫水平共同作用所产生的自然选择的结果[11,40]。

表1 部分国家疫苗接种情况及Prn缺失株的发现和流行情况

*ACV1=PT； ACV2=PT+FHA； ACV3=PT+FHA+Prn； ACV5=PT+FHA+Prn+FIM2+FIM3；-尚未发现Prn缺失株； ACV1～5：含1～5种抗原的无细胞百日咳疫苗； Prn：黏附素蛋白； PT：百日咳毒素； FHA：丝状血凝素； FIM：菌毛蛋白

3.6 Prn缺失合并其他基因变异株的出现 目前，已经被发现并记录17种由于PT编码基因的启动子区的点突变所导致的百日咳杆菌新的基因型。在对2005—2016年日本流行菌株的研究中，与ptxP3密切相关的多位点串联重复序列数变化分型中的MT27型逐渐处于统治地位，且在其中已经发现了Prn缺失株[34,46]。与此同时，在欧盟的一项调查研究中，也发现了Prn缺失株同时包括ptxP3基因型。ptxP3谱系于20世纪80年代后期首次发现，相较于ptxP1谱系能产生更多PT，并且近十几年来在使用ACVs的国家中逐渐占据统治地位[12,15]。因此，这种同时具有ptxP3基因型和Prn缺失现象的菌株，也许会更加适合ACVs免疫背景下的国家和地区，可能是将来应该重点监测和研究的菌株。

除此以外，近年的研究报告中，各国学者们也发现了PT合并Prn共同缺失的菌株。有研究证明，存在PT缺失的菌株依旧能侵入上皮细胞造成巨噬细胞凋亡，并且可产生类百日咳现象。此外，由于目前百日咳血清学诊断主要是检测特异的PT抗体，因此含有PT缺失的菌株很容易引起血清学检验的漏报现象，为临床确诊工作带来麻烦[8,26,35]。所以这种Prn缺失合并其他基因变异的菌株也应该在未来引起人们的关注和重视。

4 结 语

相对于WCVs接种后诱导的广泛免疫应答，ACVs接种后仅诱导单抗原免疫作用增加。而Prn缺失株的特点使其更容易逃避宿主免疫，拥有巨大的自然选择优势，因此这种菌株的流行大大降低了ACVs的疫苗效力，造成的百日咳流行和暴发也成为了ACVs时期被广泛关注的问题。国际上还没有建立Prn缺失株的标准菌株，因此对这一领域的探究还有极大的发展空间[26,36]。我国正处于ACVs广泛应用的初期，面对Prn缺失株为代表的ACVs抗原缺失菌株带来的挑战，必须保持足够的警惕。尽管目前国际上对于Prn缺失株的解决办法还不是很多，但是加强流行菌株的监测，建立更加完备的百日咳诊断体系，完善疫苗制作方式，更新疫苗菌株，以及继续提升疫苗覆盖率等举措，是目前国际上达成共识的应对措施和有效办法。