周 璐，王雅枫，苏娃婷，雷少青

(武汉大学人民医院麻醉科，武汉 430060)

糖尿病是一种严重危害人类身体健康的慢性疾病，我国是糖尿病的发病大国。缺血性心脏病是导致糖尿病患者死亡的最主要原因之一[1]。在临床上，有效恢复缺血心肌的血液灌注是治疗缺血性心脏病的根本途径。然而，缺血心肌在恢复血液灌注后其缺血性损伤进一步加重，即心肌缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)。循证医学研究进一步显示，糖尿病患者较非糖尿病患者更不易耐受IRI，即糖尿病心肌缺血易损性增加[2]。尽管目前关于糖尿病心肌缺血易损性增加的机制还不清楚，但心肌代谢改变可能是糖尿病IRI发生、发展过程中的重要机制。叉头转录因子O亚型1(Forkhead transceiption factor of class O1,FoxO1)是调控心肌代谢的重要因子，同时也是胰岛素信号通路中的关键转录因子。在糖尿病状态下FoxO1过度活化。现对FoxO1过度活化调控心肌代谢并导致糖尿病心肌缺血再灌注易损性增加的相关机制进行综述，为临床治疗和保护糖尿病患者心肌缺血提供潜在新靶点和依据。

1 FoxO1的结构与活性调节

1.1 FoxO1转录因子简介 FoxO转录因子家族属于进化上高度保守的转录调节因子Fox(A～S)19个超家族其中之一，由FoxO1(FKHR)、FoxO3(FKHRL1)、FoxO4(AFX)和FoxO6蛋白组成[3]。FoxO亚家族各自的表达部位不同，FoxO1主要表达于肝细胞、脂肪细胞、胰岛β细胞；FoxO3a在肿瘤细胞和肾脏中表达占主导地位；FoxO4在肌肉组织中表达丰富[4]，FoxO6主要存在于发育中的大脑[5]。FoxOs广泛存在于生物体中，参与多种细胞的生理过程，如细胞增殖、细胞凋亡、活性氧类(reactive oxygen species,ROS)反应、长寿、癌症、细胞周期和新陈代谢的调节等[6]。

FoxO蛋白的一个共同特征就是具有由110氨基酸组成的DNA结合域，是起调节作用的主要结构，由4个螺旋(H1、H2、H3和H4)，2个翼环(W1、W2)和3个β链(S1、S2、S3)组成[7]。在该结构域中，Helix-3是主要的DNA识别元件，其包含高度保守的N-X-X-R-H-X-X-C/T序列，促使其与DNA螺旋槽结合。FoxOs还含有核定位序列、核输出序列和含有反式激活结构域的C端[8]。研究表明，FoxO1可与Daf-16结合元件的5′-GTAAA (T/C) AA-3′序列和胰岛素反应序列5′-(C/A) (A/C) AAA(C/T) AA-3′结合[9]。FoxO1与下游DNA相互结合的复杂位点是FoxO1活性调节的结构基础。

1.2 FoxO1转录活性的调节 FoxO1转录活性主要受磷酸化、乙酰化和泛素化修饰方式的调节。①磷酸化修饰：FoxOs由各种蛋白激酶磷酸化来修饰调节FoxOs转录因子的位点，改变FoxO1的亚细胞定位、与DNA分子结合的亲和能力和转录活性[10-11]。FoxO1是胰岛素/胰岛素样生长因子1信号通路下游的关键转录因子[12],其活性主要受上游磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)调节，胰岛素/胰岛素样生长因子1信号通路的激活使PI3K催化形成磷酰肌醇-3,4,5-三磷酸，激活Akt。活化的Akt继而磷酸化FoxO1的Thr24、Ser256和Ser319三个磷酸化位点，引起FoxO1转录因子磷酸化[13]。磷酸化的FoxO1蛋白可特异性的与14-3-3蛋白结合，削弱了FoxO1蛋白与DNA的结合能力，从而使FoxO1转录因子从核DNA锚定位点释放出来，从细胞核转运到细胞质,从而导致FoxO1的转录活性下降，抑制FoxO1调控下游基因的表达活性[14]。PI3K/Akt活性减弱时，FoxO1呈去磷酸化状态，使其重新定位于细胞核，FoxO1转录活性增强。此外，蛋白激酶Cδ和c-Jun氨基端激酶等通过阻止磷酸化的FoxO1和14-3-3蛋白的相互结合，增强FoxO1的核定位[15-16],使FoxO1转录活性增强，见图1。②乙酰化修饰：FoxO1的乙酰化修饰发生在DNA结合区的赖氨酸残基上，这3个赖氨酸残基分别为Lys242、Lys245和Lys262。乙酰化后的FoxO1与DNA结合区的活性降低，导致其转录活性降低。然而，沉默信息调节因子(silent information regulator,Sir)2是一种去乙酰化酶，Sirt1是哺乳动物具有的7种 Sir2的其中之一。Sirt1可以催化FoxO1去乙酰化从而抑制其转录活性。③泛素化修饰：FoxO1蛋白的Ser256位点发生磷酸化后能够被Skp/Cul/F-box 蛋白泛素复合体识别后聚泛素化，泛素化作用后的FoxO1蛋白会通过蛋白酶体的解蛋白作用而降解[17]。

PI3K:磷脂酰肌醇-3-激酶;Akt:蛋白激酶B;Phosphate group:磷酸盐组;Cytosol:细胞质；Nucleus:细胞核；Nucleus export：核输出；Nucleus import：核转入；increased transcription：增加转录；decreased transcription:降低转录

2 FoxO1与糖尿病代谢

糖尿病是一组以高血糖为主要特征的代谢性疾病。其发病机制为机体内胰岛素分泌不足或机体利用胰岛素障碍(胰岛素抵抗)，而糖代谢、脂代谢异常是引起糖尿病及其心血管并发症的重要环节。如上所述，FoxO1主要表达在胰岛β细胞等[4]，这些组织是胰岛素分泌的主要部位，且与机体的糖脂代谢高度相关。

2.1 FoxO1与糖代谢 机体通过外周组织和内源性葡萄糖的产生、摄取、异生和分解来维持全身葡萄糖的稳态，肝脏是机体葡萄糖代谢的主要器官。FoxO1是胰岛素信号转导和葡萄糖稳态的主要调节因子[18]。肝脏糖异生由葡萄糖6-磷酸酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶两种关键酶控制[3]。在肝细胞中，FoxO1活化可以激活葡萄糖6-磷酸酶与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶糖异生基因的转录，参与调控血糖水平[18]。在进食状态下，胰岛素激活胰岛素受体PI3K/Akt,Akt磷酸化FoxO1,导致FoxO1离开细胞核而影响其转录活性，抑制糖异生；而在禁食状态下，胰岛素的信号较弱，FoxO1在Akt位点去磷酸化定位到细胞核中，从而诱导两种糖异生关键酶(葡萄糖6-磷酸酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶)的转录，促进肝脏糖异生，重建血糖稳态。除葡萄糖6-磷酸酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶外，FoxO1还可以调节丙酮酸脱氢酶激酶4等糖异生相关基因[19]。丙酮酸脱氢酶激酶4使丙酮酸脱氢酶复合物的亚基磷酸化，抑制其向乙酰辅酶A转化，导致丙酮酸从三羧酸循环或脂肪酸合成转向糖原异生。因此，FoxO1有助于在饥饿期间维持正常的血糖水平[12]，而在胰岛素抵抗或糖尿病的条件下，由于缺乏胰岛素信号转导的调控，过度活跃的FoxO1以不受控方式持续促进糖异生，从而导致高糖血症，最终参与糖尿病及其并发症的发生、发展[20-21]。

2.2 FoxO1与脂代谢 FoxO1参与脂质代谢并在糖尿病脂质代谢紊乱中起关键作用[22]。极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)在肝脏中组装和生成，并且受胰岛素的严格调节。禁食条件下诱导肝VLDL的生成，导致血液中VLDL增加，而餐后胰岛素的释放会抑制肝VLDL的产生限制血浆三酰甘油的累积。FoxO1在微粒体三酰甘油转运蛋白和载脂蛋白C-Ⅲ的胰岛素依赖性调节中起关键作用，微粒体三酰甘油转运蛋白与载脂蛋白C-Ⅲ分别为催化三酰甘油脂蛋白的生产和清除中的限速步骤[23]。胰岛素作用减弱时增加FoxO1活性，诱导微粒体三酰甘油转运蛋白有利于VLDL的组装，并诱导载脂蛋白Ⅲ减少外周三酰甘油分解代谢。在糖尿病受试者中，由于肝脏中的胰岛素抵抗，FoxO1过度活化，胰岛素抑制VLDL的能力受损，导致过量的VLDL分泌和血液中三酰甘油颗粒的累积，这种糖尿病脂质代谢异常表现为高三酰甘油血症[24]。

3 FoxO1与糖尿病心肌IRI的关系

3.1 FoxO1在维持正常心肌功能中的作用 正常水平的FoxO1是调节心脏稳态的重要组分，是维持心肌细胞正常代谢和存活的关键。研究显示，FoxO1缺乏引起血管和心脏发育不全，导致小鼠胚胎在10.5～11 d死亡[25]。FoxO1-/-胚胎还表现为发育不全的主动脉和心脏循环受损[26]。另有研究显示，心脏中FoxO1的缺失会诱导增加NaV1.5的表达导致Na+负荷增加和缺血性心脏病的发生[27]。

然而，FoxO1过度活化会导致心脏功能障碍。Qi等[28]研究发现FoxO1与肌球蛋白重链基因的启动子区域相互作用并刺激其表达，促进心脏肥大和损害心脏的收缩性最终导致心力衰竭。另有研究发现，糖尿病心肌FoxO1过度活化促进诱导型一氧化氮合酶的表达，进一步诱导靶蛋白如甘油醛-3-磷酸脱氢酶和胱天蛋白酶-3的亚硝基化，导致高血糖后心肌细胞死亡，从而导致糖尿病心肌功能紊乱[24]。

3.2 FoxO1过度活化导致机体代谢紊乱 FoxO1在调节心肌代谢中尤为重要。FoxO1活性受胰岛素负性调节，胰岛素通过Akt依赖途径使FoxO1磷酸化，这引起14-3-3蛋白与FoxO1磷酸化部位相结合随后从细胞核转运到细胞质，从而降低FoxO1的转录调控能力。在糖尿病状态下，FoxO1活化可增加心肌脂肪酸的摄取及氧化，同时抑制葡萄糖氧化利用率，这会引起心肌脂肪酸蓄积，当脂肪酸摄入量超过心肌细胞脂肪酸代谢能力时，将导致细胞线粒体功能紊乱而产生过量ROS致细胞损伤。ROS一方面可直接导致组织器官的氧化损伤，另一方面可造成机体一氧化氮合酶系统异常，包括内皮型一氧化氮合酶脱偶联与诱导型一氧化氮合酶过表达，由此造成的后果是机体不仅不能催化产生具有生物活性的一氧化氮，相反会诱导产生ROS具有更强蛋白硝基化能力与细胞毒性的过氧亚硝基阴离子,从而加重心肌损伤，这可能是糖尿病心脏不易耐受IRI的主要原因[29]。

4 FoxO1与糖尿病心肌IRI

目前治疗糖尿病患者缺血性心脏病的主要措施是恢复缺血心肌的有效动脉血液灌注，而缺血心肌在恢复血流灌注后其缺血性损伤进一步加重，即心肌IRI。有研究显示，在小鼠的糖尿病心肌IRI模型中，适度上调心脏中FoxO1的表达可减轻心脏损伤，而当糖尿病心脏过度表达或者FoxO1的缺失会加剧缺血再灌注诱导的心肌损伤[30]。Guo等[31]研究显示，糖尿病状态心脏的FoxO1蛋白过度活化表达,糖尿病状态增加了心肌对IRI的易感性，而FoxO1表达下调提高了糖尿病心脏对IRI的耐受性。然而过度活化的FoxO1蛋白通过中的氧化应激、自噬、凋亡等过程参与糖尿病心肌IRI。

4.1 FoxO1与糖尿病心肌IRI有关的氧化应激 FoxO1是细胞应对氧化应激反应的关键介质。线粒体是细胞内ROS的主要来源。胰岛素等因子均可通过激活还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶或线粒体途径增加ROS的生成。过量的非生理浓度的ROS会导致氧化应激。而心肌细胞在受到IRI时会产生大量的自由基，导致DNA、RNA、蛋白质和多糖的氧化、交联、变性和降解，最终导致细胞的死亡。细胞的抗氧化能力降低或增强时也会发生氧化应激。FoxO转录因子调节编码细胞内和细胞外抗氧化蛋白基因的表达,一方面FoxOs可刺激编码线粒体内超氧化物歧化酶2、过氧化物酶3等抗氧化蛋白基因的转录，另一方面ROS形成的应激刺激可以通过FoxOs的磷酸化和乙酰化等翻译后修饰改变FoxO蛋白的亚细胞定位[32]。

4.2 FoxO1与糖尿病心肌IRI有关的凋亡 细胞凋亡是决定IRI程度的特征性变化之一[33]。线粒体氧化损伤是IRI期间氧化应激增加的结果，同时这种损伤反过来会加剧IRI[34]。线粒体氧化损伤引起的线粒体通透性改变、线粒体肿胀、促凋亡蛋白释放和线粒体氧化磷酸化解偶联等一系列变化，导致线粒体结构和功能障碍最终会引起心肌细胞的凋亡。心肌氧化应激增加和抗氧化应激能力降低可使糖尿病心脏易于发生IRI诱导的细胞凋亡[35]。据报道，在糖尿病期间FoxO1通过增加胱天蛋白酶和细胞死亡受体的表达能力导致细胞死亡,除传统途径，FoxO1还可直接增加一些促凋亡蛋白如Bim、Puma的表达[36]。

在心肌细胞IRI过程中，Sirt1调节的FoxO1乙酰化水平影响心脏中凋亡途径。Hsu等[37]研究显示，Sirt1通过上调抗氧化分子和激活FoxO1来下调促凋亡分子来减少氧化应激，保护心脏降低IRI。

4.3 FoxO1与糖尿病心肌IRI有关的自噬 自噬是一种细胞程序性的死亡方式，线粒体自噬是细胞清除损伤或衰老线粒体的主要途径[38]，线粒体自噬归属于自噬。有研究表明，IRI与自噬特别是线粒体自噬功能紊乱密切相关[39]。

`机体在糖尿病状态下，心肌代谢发生紊乱，葡萄糖利用受到限制，心脏转而主要利用脂肪酸氧化供能。而细胞摄入的脂肪酸浓度超过其代谢能力时，则会导致脂肪酸蓄积。心肌细胞利用脂肪酸过多时可导致脂毒性心功能紊乱及心脏不易耐受IRI[40]。FoxO1对脂肪酸的摄取调节使其成为心脏功能的重要参与者[36]。

心肌细胞在缺血状态时，机体清除ROS的能力减弱，而心肌细胞再次恢复血液供应时，ROS大量产生甚至出现堆积，堆积的大量ROS对心肌细胞会造成直接伤害，并会导致线粒体的损伤，使线粒体产生更多的ROS，造成一种恶性循环[39]。

PINK1(PTEN induced putative kinase)是FoxOs的潜在靶点[41]，研究表明FoxO1主要通过与PINK的启动子结合发挥作用[42]。ROS等引起线粒体损伤时，阻碍PINK1从线粒体外膜进入体腔，使PINK1聚集于线粒体外膜。此时PINK1会招募Parkin到线粒体，E3泛素链接酶被激活，通过泛素化底物以激活线粒体自噬[43]。

通过适当增强线粒体自噬水平可减轻心肌IRI，而当损伤的线粒体数量超过其清除能力或机体线粒体自噬发生缺陷时，细胞会启动程序性死亡，加重心肌缺血再灌注的损伤程度[44-45]。

4.4 FOXO1与糖尿病心肌IRI有关的内质网应激 缺血等压力因素破坏内质网功能，导致蛋白质的错误折叠和展开，内质网中错误折叠和未折叠的蛋白质累积即被称为内质网应激[46]。内质网应激是糖尿病心肌病发病机制中的重要因素，过度的内质网应激可导致心肌细胞凋亡[47]，并有证据表明FoxO1过度激活与过度的内质网应激相互交织[36]。FoxO1是内质网应激的上游调节因子[36]。RNA结合蛋白QKI5使FoxO1的mRNA不稳定，进而可以抑制心肌细胞中FoxO1的表达和活化[48]。在QKI5缺失的心脏中，FoxO1过度激活并随之放大内质网应激，增强糖尿病心脏IRI的不耐受性，而糖尿病心脏中QKI5的恢复可显著减轻IRI[31]。

5 小 结

FoxO1活化是糖尿病性心肌病发展的核心[49]。冯世栋等[50]研究显示，在糖尿病小鼠心肌点注射FoxO1 siRNA来下调FoxO1表达的心肌缺血再灌注模型中，可以减轻心肌IRI。在细胞实验中，高糖孵育乳鼠心肌细胞会造成细胞内FoxO1表达量增高，加重心肌细胞缺氧/复氧后细胞损伤，转染FoxO1 siRNA的细胞内FoxO1表达量下降导致缺氧/复氧损伤减轻[51]。 FoxO1抑制剂AS1842856发挥空腹降糖作用并改善糖耐量[52]和逆转小鼠心脏不利重塑和改善收缩功能，从而提出糖尿病心肌心肌IRI是多方面综合作用的结果[53]。FoxO1作为其信号通路的共同作用靶点，参与的氧化应激、凋亡、自噬和内质网应激等在糖尿病IRI过程都发挥重要作用。糖尿病心肌缺血再灌注也是临床医师经常面临的情况，随着FoxO1在糖尿病心肌IRI的阐述，进一步了解FoxO1转录因子的作用机制，将会为临床治疗糖尿病患者心肌IRI提供的靶点与临床依据。