王瀚墨，李智敏，王元忠，肖 丹,2

(1. 云南省农业科学院 药用植物研究所,云南 昆明 650223； 2. 云南良旺生物科技有限公司,云南 昆明 650106)

玛咖(Maca，LepidiummeyeniiWalp.)，十字花科独行菜属植物，原产南美秘鲁安第斯山区海拔 3 500～4 000 m的区域.它的贮藏根曾被秘鲁当地人用于营养补充、加强体质和提高生育能力等，甚至在当地成为等价交换的中介物[1].现代研究表明，玛咖中的玛咖烯、玛咖酰胺、芥子油苷以及固醇等活性成分具有改善记忆障碍[2]、改善更年期妇女心理症状和性功能障碍[3]、改善性能力[4]、增加骨密度[5]、提高精子生成数量[6]、减少前列腺增生[7]、抗氧化、修复紫外线伤害皮肤[8]、抗疲劳等功能[9].同时玛咖富含蛋白质、氨基酸、脂肪、微量元素等多种人体必需营养成分.2002年玛咖仅在美国和日本销量就达到20亿美元，同年玛咖被引入中国云南、新疆等地进行实验性种植.2011年我国卫生部正式批准玛咖粉作为新资源食品.

目前云南已建成全国最大的玛咖规模化育种及种植基地，推广栽培已达10万亩，产量占据全国的95%以上.丽江、中甸、昭通以及怒江、昆明的部分地区均有种植，但品质略有参差.为使玛咖的鉴别及质量得到有效控制.本文采用氯仿快速提取法，并用三组平均值、四点平滑、一次微分等方法校准和排除干扰，利用共有峰率和变异峰率双指标系列法分析云南地区不同产区玛咖紫外指纹图谱相似性.结果表明，该方法具有稳定性高、重现性好等特征，为快速、准确鉴别云南不同产区玛咖，品质评价提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

其中前10份玛咖样品采集于云南省玛咖各主要种植区，所有玛咖样品均选择各地玛咖平均大小的个体并将其混合磨粉.P号样品购自秘鲁，见表1.

1.2 主要仪器与试剂

UV-2550双通道紫外可见分光光度计(岛津公司，配有UV probe工作站)；SY3200-T型超声波清洗机(上海声源超声仪器设备有限公司)；AR1140型万分之一分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；FW-100型高速粉碎机(天津市华鑫仪器厂)；九阳JYL-C012多功能料理机(九阳股份有限公司)；0.301 mm标准筛盘(浙江上虞市道墟五四仪器厂)；130 mm陶瓷研钵.

表1 样品来源

石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇(均为AR)；浓盐酸、氢氧化钠(均为CP)；二次蒸馏水.

1.3 紫外光谱测试样品制备及测定条件

样品50 ℃烘干，粉碎，研细使其全部通过0.301 mm标准筛，保存于自封袋内备用.准确称取1.500 g样品于25 mL比色管中，加入20 mL提取溶剂，室温超声提取40 min，经3层滤纸获得待测试样品.以所选溶剂作为参比液，设定扫描波长为200～600 nm，重复3次，狭缝1.0 nm，采样间隔0.2 nm进行紫外光谱测定.

1.4 紫外光谱处理

所测玛咖紫外原始光谱依次进行3组平均，4点平滑，1次微分处理，以滤除光谱噪音，校准基线，提高图谱分辨率和测定准确度[10].

2 方法与结果

2.1 最佳提取溶剂和提取时间

以秘鲁产玛咖P号样品为对象，分别使用石油醚、石油醚与氯仿混合液(V∶V=1∶1)，氯仿、氯仿与乙酸乙酯混合液(V∶V=1∶1)、乙酸乙酯、甲醇、95%乙醇和双蒸水作为溶剂，料液比0.020、0.025、0.030、0.040、0.050、0.075、0.100、0.200、0.300 g/mL，超声时间0、10、20、30、40、50、60 min交叉进行紫外测定，以1.3节方法测定3次，并以1.4节方法对结果进行处理.筛选溶液实验紫外光谱结果见图1.

结果表明，氯仿作为提取溶剂，料液比0.075 g/mL，超声时间40 min提取玛咖紫外吸收峰数明显多于或等于其它溶剂、料液比和超声时间提取的吸收峰数.

2.2 稳定性实验

取一份保存在0～5 ℃的样品3提取液，分别在2、4、6、8、10 h时进行紫外光谱测定，光谱数据经1.4处理后8 h以吸收波长计算的RSD%在0.06%～2.33%之间.结果表明，该方法在8 h内样品保持稳定.

2.3 重现性实验

以样品3为考察对象，称取0.100 0 g样品5份，以氯仿为溶剂1.3法制取测试液并进行紫外光谱扫描，光谱数据经1.4处理后以吸收波长计算平均相对标准偏差RSD%在0.09%～1.81%之间，表明该方法重现性好.

2.4 云南地区不同产区玛咖紫外指纹图谱

通过2.1～2.3节实验，本研究最终选用超声40 min，料液比0.075 g/mL的玛咖氯仿提取液作为紫外光谱检测的制备液.云南地区不同产区玛咖紫外指纹图谱见图2.

2.5 紫外指纹图谱共有峰和变异峰的确定

本研究采用W正态分布检验不同紫外光谱中的共有峰.对于不符合正态分布，又十分接近的一组吸收峰，则采用组内各吸收峰波长的极差值与本组及相邻组之间的平均波数差值进行比较，当极差值显著小于平均波数值时视为一组共有峰，反之视为变异峰[10].玛咖紫外指纹图谱吸收峰波长数据及共有峰的识别，见表2.

序号吸收峰波长λ/nm1238.60 219.40 207.60 203.60 2276.00238.20 220.80 216.20 213.20 210.80 204.20 202.40 3211.60 208.80 4275.40241.00 213.60 208.80 206.80 200.20 5275.20241.80 217.80 206.80 204.40 200.60 6303.20240.00 224.60 217.40 211.40 206.80 204.20 7225.40 221.60 216.20 211.00 204.60 8223.60 216.80 212.60 210.00 207.00 9279.00241.80 227.00 225.40 221.00 214.80 209.60 206.60 10259.40229.40 226.00 220.40 214.20 210.40 208.20 P276.80275.00222.80 217.80 212.80 210.40 207.60

注：在表中属于同一列的吸收峰为共有峰.

不同产区玛咖紫外指纹图谱双指标序列分析结果计算紫外指纹图谱共有峰率和变异峰率使用公式如下[11]：

共有峰率P=Ng/Nd×100%,

(1)

变异峰率Pva=na/Ng×100%,

(2)

Pvb=nb/Ng×100%,

(3)

其中：Ng代表2个图谱中共有峰数，Nd代表独立峰数(Nd=Ng+na+nb)，Pva代表a图谱的变异峰率，na代表a图谱的变异峰数，Pvb代表b图谱的变异峰率，nb代表b图谱的变异峰数.

对云南地区不同产区玛咖紫外指纹图谱共有峰率和变异峰率双指标序列分析结果如表3.

表3 样品间的共有峰和变异峰率

续表3

序列P;Pva,Pvb(%)序列P;Pva,Pvb(%)序列P;Pva,Pvb(%)4∶940;50,1005∶P30;100,133.36∶P40;75,754∶837.5;100,66.75∶927.3;100,166.76∶137.5;133.3,33.34∶333.3;200,05∶125;200,1006∶236.4;75,1004∶630;100,133.35∶722.2;200,1506∶430;133.3,1004∶125;200,1005∶822.2;200,1506∶530;133.3,1004∶710;500,4005∶314.3;500,1006∶312.5;600,1007∶650;25,758∶1071.4;0,409∶666.7;33.3,16.77∶244.4;80,508∶962.5;0,609∶1066.7;33.3,16.77∶944.4;25,1008∶650;25,759∶P66.7;33.3,16.77∶842.9;66.7,66.78∶P50;25,759∶862.5;60,07∶1033.3;66.7,133.38∶742.9;66.7,66.79∶245.5;166.7,166.77∶P33.3;66.7,133.38∶340;150,09∶744.4;100,257∶128.6;150,1008∶437.5;66.7,1009∶440;100,507∶522.2;150,2008∶230;66.7,166.79∶133.3;166.7,33.37∶316.7;400,1008∶522.2;150,2009∶527.3;166.7,1007∶410;400,5008∶112.5;400,3009∶325;300,010∶871.4;40,0P∶966.7;16.7,33.310∶966.7;16.7,33.3P∶1055.6;40,4010∶462.5;40,20P∶250;250,166.710∶655.6;40,40P∶850;75,2510∶P55.6;40,40P∶444.4;75,5010∶250;250,166.7P∶640;75,7510∶733.3;133.3,66.7P∶733.3;133.3,66.710∶530;133.3,100P∶530;133.3,10010∶328.6;250,0P∶328.6;250,010∶122.2,250,50P∶122.2,250,50

注：*1∶6 37.5；33.3，133.3，这一数据表明：以1号样品吸收峰为对照，用6号样品吸收峰进行比较；比较结果显示：1号样品与6号样品吸收峰的共有峰率为37.5%，1号样品吸收峰的相对变异峰率为33.3%，6号样品吸收峰的相对变异峰率为133.3%.从共有峰率和变异峰率综合看，二者之间相似性较小，差异性较高.

表3结果表明，云南不同产区的玛咖存在一定的差异，这种差异可以通过紫外指纹图谱的样品间的变异峰进行区分，而这种差异与产区间空间距离无关.同一地域产区玛咖的紫外指纹图谱比较，仍存在相似性较小，而差异性则较高的情况，如：香格里拉建塘与香格里拉小中甸样品间比较(1∶2,33.3%，33.3%，166.7%)，昭通昭阳区与昭通大山包样品间比较(3∶10,28.6%，0%，250%)，昆明东川与禄劝轿子雪山样品间比较(4∶9,40%，50%，100%)，会泽大海乡与会泽乌蒙山样品间比较(5∶8,22.2%，200%，150%)，丽江巨甸与丽江云岭样品间比较(6∶7，50%，75%，25%).而如9号禄劝轿子雪山样品(9∶P,66.7%)、10号昭通大山包样品(10∶P，55.6%)、8号会泽乌蒙山样品(8∶P,50%)和2号香格里拉小中甸样品(2∶P，50%)的吸收峰与秘鲁的P号样品的吸收峰较为相似，但仍具有一定的差异性.

3 结语

在紫外条件下利用双指标序列法，通过3组平均，4点平滑，1次微分处理建立了云南产玛咖紫外指纹图谱.该方法精密度高、稳定性好、重现性好，能准确定性反映任意2个样品之间的相似和差异情况，同时能从整体上对其进行分组，与常用的模糊聚类相比更为客观、直接，为农产品定性评价奠定了基础.

紫外指纹图谱显示，云南不同产区玛咖样品间最大共有峰率达75%，最小共有峰率为0%，变异峰率最大为∞，最小为0%.玛咖样品紫外指纹图谱可以有效的区分云南地区不同产区的玛咖样品.不同样品间紫外指纹图谱相似性程度与其产区间的距离无关，这可能与云南地区种植玛咖时间短，玛咖种源来源复杂以及云南地区小区域地理、气候多元性有关.以样品紫外吸收峰的共有峰率和变异峰率作为标志，禄劝轿子雪山样品、昭通大山包样品、会泽乌蒙山样品和香格里拉小中甸样品与秘鲁产的玛咖成分更为接近，但仍具有一定的可识别的差异性.以上数据将为云南地区玛咖的产区鉴别，以及种源筛选和种植区域选择提供一定的理论依据.