高瑞平，梁 琪*，白莉莉，石永祺

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃省功能乳品工程实验室，甘肃 兰州 730070）

目前，全球乳制品加工排放的乳清液总产量约为（180～190）×106t/年，仅有约50%的乳清液被处理和使用，其中，被处理的乳清液中仅有30%用于生产乳清粉[1]。根据生产工艺[2]，乳清液通常分为甜乳清液、酸乳清液、咸乳清液和原乳清液。原乳清液是调节牛乳pH值至4.6，分离酪蛋白沉淀后剩余的液体部分；然而，乳品工业中最普遍的是甜乳清液，它来源于酶凝型干酪生产过程的副产物，是国际上乳清液产量最大的一种。将乳清液浓缩、干燥制成的粉末状产品称之为乳清粉（whey powder，WP）。牦牛乳原乳清液和甜乳清液干燥之后的产品分别称为牦牛原乳清粉（native yak whey powder，NYW）和牦牛甜乳清粉（sweet yak whey powder，SYW）。乳清粉总蛋白含量一般为11%～24%，乳糖含量小于60%，乳清粉中的乳清蛋白占牛乳总蛋白质的0.7%，含有20 种氨基酸，在营养学上被称为“蛋白之王”[3]。

牦牛乳作为我国青藏高原地区特有的优质乳源，蛋白质含量（4.0%～5.9%）高于荷斯坦牛乳蛋白含量（2.3%～4.4%）[4]。近年来，牦牛乳产量已增加至4 000 万t[5]，约25%通过现代加工业生产[6]。国际上，荷斯坦牛乳加工干酪、酸乳、酪蛋白及乳粉等产品是形成乳清废液的来源，随着牦牛乳品企业的建立和加工量的增大，对牦牛乳清液的回收利用有利于降低生产成本，提高牦牛乳品企业的经济效益。目前，国内外市场销售的乳清产品主要是来源于荷斯坦牛乳的乳清粉，牦牛乳清产品在国内外市场较为缺乏。学者们通过对荷斯坦乳清粉的化学组成和形态等理化指标的研究确定乳清粉的质量特性[7]。Banavara等[8]研究甜乳清粉的pH值、蛋白质含量、浊度、颜色和粒度分布等物理特性及溶解性、起泡特性等功能特性，发现起泡性能受甜乳清粉粒径、亮度值影响较大，蛋白质含量影响溶解性。

本研究采用酸沉淀和酶凝方式分别制取SYW和NYW，通过对总蛋白质、乳糖、灰分含量和pH值等指标进行分析，同时对溶解性、持水性、持油性、起泡性、乳化性和热稳定性等功能性质进行研究，以期系统揭示牦牛乳清粉的功能性质，为牦牛乳清粉加工产业和市场化应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜牦牛乳采自甘肃天祝县抓喜秀龙乡牧民家中；NYW为新鲜牦牛乳脱脂、酸沉淀分离酪蛋白制取的乳清液真空冷冻干燥之后得到；SYW为甘肃省功能乳品工程实验室牦牛乳硬质干酪制作过程中收集的甜乳清液直接真空冷冻干燥制取；进口荷斯坦乳清粉（Holstein whey powder，HW）为市售；所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SP-723紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；SH220N石墨消解仪 济南海能仪器有限公司；SKD-200凯氏定氮仪 上海沛欧分析仪器有限公司；SCIENTZ-10ND冷冻干燥机、XHF-D高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；QL-866旋涡混合器 江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司；L500医用离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

NYW的制备：牦牛酸乳清液由鲜牦牛乳10 000 r/min离心30 min脱脂，调节pH值至4.6进行等电点沉淀，3 500 r/min离心20 min，收集上清液，真空冷冻干燥制得。

SYW的制备：实验室硬质干酪制作过程中收集乳清废液，真空冷冻干燥制得。

1.3.2 牦牛乳清粉主要组成测定

蛋白质总量测定：参考GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法；乳糖含量测定：参考SNT 0871—2012《出口乳及乳制品中乳糖的测定方法》中的分光光度计法；灰分含量测定：参考GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》；乳清粉溶液酸度采用pH计法进行测定。

1.3.3 牦牛乳清粉功能指标测定

1.3.3.1 溶解性的测定

配制质量浓度5 g/100 mL的牦牛乳清粉溶液，25 ℃恒温振荡1 h，10 000 r/min离心5 min，取上清液。用凯氏定氮法测上清液的蛋白质含量，每个样品重复实验3 次，溶解性按照公式（1）计算[9]。

式中：C1为上清液中蛋白质含量/（g/100 g）；C为样品中蛋白质含量/（g/100 g）。

1.3.3.2 持水性和持油性的测定[10]

持水性：用预先称质量后的离心管准确称取2.0 g样品，缓慢加水，每加几滴水，就用旋涡混合器混合几分钟，直至样品呈浆状且无水析出时为止；于10 000 r/min离心3 min，倒去上层清液，称质量；离心后若无上清液，再加水搅匀离心，直至离心后有少量上清液为止。持水率按照公式（2）计算。

式中：m1为空试管的质量/g；m2为试管加样品的质量/g；m3为沉淀物加试管的质量/g。

持油性：将1 g（精确到0.001 g）样品溶于含25 mL大豆色拉油的离心管，用旋涡混合器混合30 s；油混合物在4 200 r/min的条件下离心分离30 min，测定分离出的油体积。持油率以每克蛋白质样品吸收油的毫升数表示，按照公式（3）计算。

式中：V0为25 mL；V1为离心分离出油的体积/mL；m为样品质量/g。

1.3.3.3 起泡性的测定

取40 mL 2 g/100 mL的牦牛乳清粉溶液，用内切式高速分散器10 000 r/min搅打1 min，快速将泡沫转移至量筒中，测量搅打后的泡沫体积和静止10 min时的泡沫体积。起泡能力用经搅打后蛋白质分散物的体积增加量表示，起泡能力和泡沫稳定性分别按照公式（4）～（5）计算[11]。

式中：V0为搅打后泡沫的体积/mL；V10为放置10 min后的泡沫体积/mL；V为搅打前样品溶液的体积/mL。

1.3.3.4 乳化性的测定

取2 g/100 mL的牦牛乳清粉溶液21 mL，边搅拌边加入纯大豆色拉油9 mL，然后以10 000 r/min的速度高速匀浆1 min制成乳状液；乳状液放置10 min时小心地从玻璃容器底部取100 μL乳化液加入到5 mL、0.1%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液中，混匀，利用紫外-可见分光光度计于500 nm波长处测量其吸光度，用0.1%的SDS溶液为空白调零。采用乳化活性指数（emulsifying activity index，EAI）及乳化稳定性指数（emulsifying stability index，ESI）来表示乳化特性。EAI是指在乳化体系中每克蛋白质所产生的界面面积的大小，ESI是指蛋白质持油水混合不分离的乳化特性对外界条件的抗应变能力。EAI和ESI分别按照公式（6）～（7）计算[12]。

式中：ρ为样品溶液质量浓度（2 g/100 mL）；φ为油相所占的体积分数（2%）；A500nm为500 nm波长处的吸光度；n为样品稀释倍数；A0为0时刻的吸光度；A10为10 min后的吸光度。

1.3.3.5 热稳定性的测定

测定依据是热处理时蛋白质在溶液中的溶解程度。将2 g/100 mL的牦牛乳清粉溶液分别在60、65、70、75、80、85、90、95 ℃水浴中加热30 min；取出后立即冰浴2 min，恢复至室温；然后称取热处理后的溶液于2 500 r/min离心10 min，倒出上层溶液，称取下层沉淀物质量，按照公式（8）计算沉淀率[13]。沉淀率越大，稳定性越差。

式中：m1为下层沉淀物质量/g；m为溶液中总蛋白量/g。

1.4 数据处理

实验数据采用Excel软件统计，Origin 2018软件作图，最终实验结果应用SPSS 19.0软件中的单因素方差分析（ANOVA）进行显著性分析，以P＜0.05具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 牦牛乳清粉主要成分分析

表1 牦牛乳清粉的主要成分Table 1 Main components of yak whey powder

由表1可知，NYW和SYW的总蛋白质含量存在显著差异（P＜0.05），SYW的总蛋白质含量为17.323%，比NYW高出3.433%，Alsaed等[14]研究发现，荷斯坦原乳清液总蛋白质含量和甜乳清液总蛋白质含量存在类似差异。甜乳清液是酶凝型硬质干酪的副产物，在干酪生产中添加凝乳酶促进酪蛋白凝乳，凝乳期间凝乳酶切割κ-酪蛋白的Phe105-Met106键，产生p-κ-酪蛋白和糖巨肽（glyco macro peptide，GMP），p-κ-酪蛋白附着在酪蛋白胶束的表面进入干酪中，而GMP则保留在乳清液中，使甜乳清液总蛋白含量升高。HW的总蛋白质含量最低，为11.620%，与NYW、SYW均差异显著（P＜0.05）。NYW和SYW灰分含量差异显著（P＜0.05），NYW比SYW高出3.156%，Alsaed等[14]也发现，荷斯坦原乳清液和甜乳清液灰分含量差异显著（P＜0.05）。有研究指出，pH值影响荷斯坦乳清液中的矿物质含量，主要是由于pH值对磷酸钙盐平衡产生不同程度的影响，溶液pH值为7.2时，乳清液中H2PO4-的含量最高，达到75%，当pH值降至5.0～6.2，导致H2PO4-含量增加，破坏了磷酸钙盐平衡，导致大量的磷酸盐和钙盐溶解在乳清液中，当pH值小于5.0时，这种变化趋势更明显[15]。HW灰分含量最低，为4.766%，显著低于NYW和SYW（P＜0.05），LI Haimei等[5]测定表明，牦牛原料乳矿物质总量高于荷斯坦原料乳。

2.2 牦牛乳清粉溶解性分析

图1 牦牛乳清粉的溶解性Fig. 1 Solubility of yak whey powder

溶解性是物质的固有特性，乳清粉的溶解性影响其在乳化和起泡等方面的应用[16]。由图1可知，NYW和SYW溶解性有显著差异（P＜0.05），SYW的溶解性比NYW高出7.128%。溶解性受到乳清粉pH值对β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-Lg）聚合形式的影响，Cheison等[17]研究指出，牛乳pH值对蛋白质结构起决定性作用，尤其是对β-Lg的结构影响较大，β-Lg占乳清蛋白的50%以上，其聚合物形式决定溶解性大小，当溶液pH值在5.1～7.0时，β-Lg主要以二聚体形式存在，此形式下β-Lg的溶解性高，而pH值在3.7～5.1时，β-Lg生成八聚体聚合物，溶解性较低。

2.3 牦牛乳清粉持水性及持油性分析

由图2可知，N Y W的持水率显著高于S Y W（P＜0.05），最高值达到45.2%，持油率显著低于SYW（P＜0.05），SYW的持油率为4.073 mL/g。生产干酪的原料乳要经过巴氏杀菌的热处理，甜乳清液中β-Lg和κ-酪蛋白相互作用产生影响；一些学者指出，热处理使荷斯坦乳清粉中β-Lg部分变性，变性的乳清蛋白与酪蛋白胶束表面的κ-酪蛋白通过巯基-二硫键交联形成聚合物，蛋白质分子疏水基团暴露出来并重新排列，疏水相互作用增强，蛋白质和水结合能力下降，从而改善SYW的持油能力，但同时降低SYW的持水能力[18-19]。本研究中市售HW的持水率和持油率最低，分别为15.5%和2.223 mL/g。

图2 牦牛乳清粉的持水性及持油性Fig. 2 Water-holding capacity and oil-holding capacity of yak whey powder

2.4 牦牛乳清粉起泡性及泡沫稳定性分析

图3 牦牛乳清粉的起泡能力及泡沫稳定性Fig. 3 Foaming ability and foam stability of yak whey powder

由图3可知，NYW和SYW的起泡能力和泡沫稳定性均存在显著性差异（P＞0.05），差值分别为2.33 mL和6.946%，HW由于起泡量太少不进行对比。造成起泡能力差异性的主要原因有2 个，其一是NYW和SYW的总蛋白质含量存在显著差异（P＜0.05），Martinez-Padilla等[20]发现，不同蛋白质含量的荷斯坦乳清蛋白起泡能力不同，起泡能力随着乳清蛋白含量的增加而提高，这是由于随着蛋白质含量增加，空气-水界面的蛋白质吸附能力增强，乳清蛋白中的β-Lg竞争性分布在空气-水界面，起泡能力增强。Kamath等[21]也指出，蛋白质含量较高时，空气-水界面吸附的蛋白质含量较高，形成较厚的黏弹性膜，泡沫不易发生破裂，泡沫稳定性增强。其二是乳清液来源不同造成SYW泡沫稳定性的差异性，Kamath等[21]研究发现，热处理过程中，变性乳清蛋白和κ-酪蛋白形成胶束物质，改善荷斯坦乳清蛋白的泡沫稳定性，这是由于形成的胶束物质分散在泡沫空气-水界面，界面黏性增强，形成的黏弹性膜稳定性较好，不易受外界条件影响。

2.5 牦牛乳清粉乳化活性及乳化稳定性分析

图4 牦牛乳清粉的乳化活性及乳化稳定性Fig. 4 Emulsifying activity and emulsion stability of yak whey powder

乳化性是蛋白产品的重要功能特性之一，对产品最终形成稳定的乳液体系发挥重要作用[22]。由图4可知：NYW和SYW的EAI和ESI均有显著性差异（P＜0.05），SYW的EAI为2.399 m2/g，ESI达45.87%，与NYW的差值分别为0.338 m2/g和12.534%；HW的ESI比牦牛乳清粉低，为30.137%。Ye Aiqian[23]研究荷斯坦乳清蛋白乳化特性后指出，蛋白质含量决定乳液稳定性大小，含量越高，EAI和ESI越高。此外，热处理会改善乳液稳定性，热处理导致蛋白质聚集，聚集体可能会限制表面蛋白的有效扩散和重排，从而提高乳液稳定性。这同时阐述了SYW的乳化活性和乳化稳定性较好的原因。

2.6 牦牛乳清粉热稳定性分析

图5 牦牛乳清粉的热稳定性Fig. 5 Thermal stability of yak whey powder

热处理广泛应用于牛乳加工过程，以延长乳制品的货架期，乳清蛋白是一种热不稳定性物质，在热处理过程中极易发生变性[24]，本研究探究牦牛乳清蛋白在60～90 ℃的热稳定性。由图5可知：NYW和SYW在60 ℃条件下的沉淀率分别为0.055%和0.077%，说明牦牛乳清粉60 ℃时开始发生变性；NYW和SYW在75 ℃以后沉淀率均显著增高，85 ℃时达到最大值，分别为0.151%和0.175%，随后沉淀率均变化不显著（P＞0.05），表明NYW和SYW在85 ℃最不稳定，易产生沉淀。不同的处理温度会不同程度影响产品的功能性质，Corredig等[25]研究70～90 ℃热处理温度下荷斯坦乳清蛋白和酪蛋白间的热诱导机制后指出，热处理温度在75～90 ℃时，随着热处理温度的升高，发生变性的荷斯坦乳β-Lg含量增加，变性的β-Lg和κ-酪蛋白胶束相互作用增强，当温度达到90 ℃时，α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）开始变性，变性的α-LA和β-Lg不仅和κ-CN发生相互作用，它们之间也存在相互作用，这说明热处理影响乳清蛋白结构，从而改变乳清蛋白的功能性质。Laleye等[26]研究表明，热处理降低了荷斯坦乳清蛋白的热稳定性。HW在80 ℃时沉淀率最大，说明来源于荷斯坦牛乳的HW在80 ℃最不稳定。

3 结 论

NYW和SYW的总蛋白质含量均显著高于HW（P＜0.05），可以作为优质蛋白质资源应用和开发。NYW和SYW的热变性温度为85 ℃，明显高于HW的热变性温度（80 ℃）。SYW是回收利用干酪加工排放的乳清废液，该乳清液经历了干酪加工前原料乳的巴氏杀菌热处理，该处理有效提高了SYW的溶解性、持油性、起泡能力、泡沫稳定性、乳化活性和乳化稳定性。本研究表明，牦牛乳清粉营养价值高，功能特性突出，具有极好的应用前景，研究结果为牦牛乳清粉的应用和发展提供了重要理论依据。